乳与乳制品微生物检验方法,菌落总数的测定,一.术语 菌落是指在因体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计的相同的细茵集合而成。 菌落总数是指食品检样经处理后，在一定条件下培养后（如营养成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1ml（g）检样中所生长的细菌菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。所以厌氧或微需氧茵、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有的生长条件不能满足其生理要求，故难以生长。因此菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被 称为杂菌数，需氧菌数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,二.设备和材料 培养箱：361 冰箱：04 恒温水浴：461 天平 电炉 吸管 广口瓶或三角瓶：容量为500ml 玻璃珠：直径50mm 平皿：直径约90 mm 试管 放大镜 菌落计数器 酒精灯 均质器或乳钵 试管架 灭菌刀或剪子 灭菌镊子 培养基和试剂 营养琼脂培养基：按GB4789.28中4.7规定或按购买的商用培养基配方配制。 生理盐水 75%乙酵溶液,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,三. 检验程序 菌落总数的检验程序如下：,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,检 样,做成风个适当倍数的稀释液,选择23个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中 361、48h2h,每个皿内加入适量营养琼脂,菌落计数,报 告,四. 操作步骤 .检样稀释及培养 1）以无菌操作将检样25g（或ml）剪碎放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭玻璃瓶内，（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以800010000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。 2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,3）另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。 4）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释淮于灭菌平皿内。 5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46的营养琼脂培养基（可放置于461水浴中保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内做空白对照。 6）待琼脂凝固后，翻转平板，置361培养箱内培养482h,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,五.菌落计数方法 .作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必须时用放大镜，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数 . .菌落计数的报告 1）平板菌落数的选择 .选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数的测定标准，一个稀释度选用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很多均匀，可计算半个平板后乘2代表全皿菌落数。平板内有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,2）稀释度的选择 .应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表中例1）。 .若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者的比值来确定。若其比值小于或等于2，应报告平均数；若大于2则报告其中较小的数字，（见表中例2及3）。 .若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例4）。 .若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例5）。 .若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告（见表中例6）。 .若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例7）。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,.菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面得数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示（见表中“报告方式”栏）。 稀释度选择及菌落数报告方式,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,六. 操作注意事项 培养基温度应在461，温度守高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混合，琼脂应放在水浴锅内，温度为461。 尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。 检样稀释后，应尽快接中，倾到培养基。一般从检样稀释开始到倾到培养基，应在15min内操作完毕。 注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少而高稀释度使菌落反而增大。 对照试验。为了避免微小颗粒与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到4环境中，以便计数菌落时用作对照。 培养湿度。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15%。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,七.菌落计数及报告注意事项 如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释小的平板上菌落数高,有两种可能性：一是检验 工作中发生差错；二是受防腐剂影响。这二种情况不可用作检样计数报告的依据。 如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细胞块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而应在稀释最大的平板上，任意数其中两个平方厘米中的菌落数，除以2求出1cm2内平均菌落数，乘以皿底面积63.6,再乘以其稀释倍数，以此结果作报告，例如：10-110-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是60个，皿底直径为9，则该检样每克（或ml）中“估计”菌落数为： 60263.61000=1.9106 63.6是按皿底直径为9时计算而得的面积,如所用平皿底直径不是9,应另求面积. 签于检样中的细菌是以单个、成双、链状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可来源于单个细胞，故平板上所得需氧和兼性厌氧的菌落数应以单位重量（g）或容量（ml）的菌落形成单位（Colony formingunits CFU）报告更恰当。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,乳与乳制品中大肠菌群的测定方法,刘晓燕,菌落总数的测定,一.术语 群：两个不同种的微生物之间经常会出现一些介于这两种之间的中间类型的菌种。 例如：大肠杆菌与产气肠细菌两种之间的区分是十分明显的，但另外还有一些菌种介于这两种之间的中间类型，就是说，他们在亲缘关系是比较接近一些菌种。在分类上，就是大肠杆菌，产气肠细菌和一些中间型的菌种合归为一群，就是大肠菌群。 大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,二.设备和材料 温箱：361 冰箱：04 恒温水浴：461 天平 显微镜 均质器或乳钵 平皿：直径90mm 试管：18180和20200 吸管1ml和10ml 广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml 玻璃珠：直径约5mm 载玻片 酒精灯 试管架 培养基和试剂 乳糖胆盐发酵管：按GB4789.28中4.9规定或按购买的商用培养 基配方配制。 伊红美兰琼脂平板：按GB4789.28中4.25规定或按购买的商用培 养基配方配制。 乳糖发酵管：按GB4789.28中4.10规定或按购买的商用培养基配 方配制。 生理盐水 革兰氏染色液：按GB4789.28中2.2规定,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,.,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,三 、检验程序 大肠菌群检验程序如下：,四. 操作步骤 检样稀释 以无菌操作检样25ml(或g)放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，800010000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：10的稀释液。 另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭吸管。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。 乳糖发酵实验 将待检样品接种于糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361培养箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置361培养箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染 色和证实实验。 证实实验（复发酵实验） 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361培养箱内，培养242h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。 报告 根据证实为肠菌群阴性的管数查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的最可能数。,茵落总数是指食品检样经处理后，在,一定条件下培养后（如营养成分,五、注意事项： 1）初发酵和证实试验 乳糖发酵试验系样品的发酵，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵 阳性并不代表在大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实试验。 在食品检验上（个别除外）一般来说，来反上有典型的较多的大肠菌群菌落，革兰氏阳性杆菌，即可做出判断。如果典型菌落甚少，则应多挑选几个菌落做证实试验，只做初发酵即判断，对某些食品来说误差是很大的。有数据表明，食品中大肠检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差很大。因此，在实