小鼠实验胚胎技术与应用,眼科学实验动物中心 黄冰,提纲,一、小鼠实验胚胎技术 1、母鼠超数排卵 2、胚胎收集 3、胚胎体外培养 4、假母制备 5、胚胎体内移植 二、应用:转基因动物模型的制作 1、定义 2、制作方法和原理,小鼠实验胚胎技术,超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的成熟卵子。 PMSG（孕马血清促性腺激素）：促进卵泡成熟。 HCG（人绒毛膜促性腺激素）：促进卵泡成熟和卵子排放。,假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，子宫内膜会处于增殖和接受胚胎着床的生理状态。一旦有胚胎进入子宫腔内，胚胎便可以在其子宫内着床发育成个体。 鼠类动物、兔子有此特性，其他动物需借助激素。,小鼠实验胚胎技术的应用 -转基因动物模型的制作,转基因动物:,转基因动物(transgenic animal)是指以实验手段导入的外源基因在其基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,转基因动物模型:,转基因动物模型(transgenic animal model)是指利用转基因动物制作手段导入的人类疾病基因在其基因组稳定整合、遗传并表达产生类似于人类疾病的一类动物。,LIM1基因敲除无脑小鼠,震颤小鼠与多发性硬化,震颤小鼠与多发性硬化,转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理,精体载体法：,将外源基因附着在精子上，通过体外受精或单精子注射法将外源基因导入受精卵；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。,精体载体法流程图,目的基因克隆、纯化 与精子共孵育 卵子 体外受精或单精子注射 受精卵DNA复制，外源基因整合 双细胞期胚胎假母体内移植 产生个体 外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群,精子载体法,精体载体法特点：,优点：简单 不需要构建特殊的载体 单纯的外源基因DNA片段 缺点：成功率低,雄原核注射法：,通过显微注射的方法将外源基因注射入受精卵的雄原核区；在受精卵DNA复制过程中外源基因随机整合入受体基因组。,雄原核注射法流程图,目的基因克隆、纯化 显微注射至受精卵雄原核 受精卵DNA复制，外源基因整合 双细胞期胚胎假母体内移植 产生个体 外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群,雄原核注射法特点：,优点：相对简单、成功率高 不需要构建特殊的载体 单纯的外源基因DNA片段 成功率可达5%25% 缺点：需要昂贵的仪器设备 显微注射仪、拉针仪、煅针仪,胚胎感染法：,将外源基因连接上逆转录病毒载体，再让逆转录病毒载体感染着床前后的胚胎，外源基因随机整合入受体基因组。,胚胎感染法流程图,目的基因克隆、纯化、逆转录病毒载体的构建 体外感染着床前胚胎 体内感染着床前、后胚胎 （共孵育或显微注射） （输卵管或子宫内注射） 胚胎移植 产生个体 筛选阳性嵌合体 嵌合体之间交配 外源基因阳性纯合个体产生、筛选 外源基因阳性个体的培育和建群,胚胎感染法特点：,优点：感染率高 缺点：相对复杂 存在生物安全性问题 形成嵌合体 后期工作量大,曲细精管注射法：,将外源基因注射入雄性动物的曲细精管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随机整合入受体基因组，再通过精卵受精产生带有外源基因的个体。,曲细精管注射法流程图,目的基因克隆、纯化 逆转录病毒载体的构建 雄性个体曲细精管注射 外源基因随机整合入雄性生殖细胞 雌、雄动物自然交配 产生个体 外源基因阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群,曲细精管注射法特点：,优点：相对简单 不需要昂贵仪器 缺点：成功率较低,胚胎干细胞法：,将外源基因转染胚胎干细胞，再通过嵌合体技术或核移植技术产生带有外源基因的胚胎干细胞来源的转基因个体。,胚胎干细胞法流程图,目的基因克隆、纯化 转染胚胎干细胞及阳性细胞筛选 受体囊胚腔注射 核移植至受体卵母细胞 胚胎移植 胚胎移植 产生嵌合体 产生阳性克隆个体 嵌合体之间交配 外源基因纯合阳性个体筛选 阳性个体的培育和建群,嵌合体动物： 组成一个动物个体的细胞来源于两 个或两个以上的动物品系或品种。,嵌合体动物制作方法：,一、聚合法 1. 胚胎-胚胎：两个8细胞期桑椹期的胚胎去透明带后，在植物血凝素的作用下，互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎，移植后发育成一个个体。,2. 胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期桑椹期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝素的作用下，形成一个融合胚胎，移植后发育成一个个体。 聚合法的特点：不需要昂贵仪器，但成功率低。,二、显微注射法 1. 成体细胞：将成体细胞显微注射入囊胚期胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。 2. 胚胎干细胞：将胚胎干细胞显微注射入囊胚期胚胎囊腔，移植后发育成一个个体。 显微注射法的特点：需昂贵仪器，但成功率高。,* 成体细胞不具有体外无限增殖能力，不适于进行遗传修饰；而胚胎干细胞刚好相反，所以普遍用于转基因动物特别是基因敲除动物的制作。,胚胎干细胞法特点：,优点：可以进行基因定点的敲除和导入 缺点：环节多、过程复杂 需要昂贵仪器,核移植法：,将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞，带有外源基因的细胞作为核供体，通过核移植技术产生带有外源基因的转基因个体。,核移植法流程图,目的基因克隆、纯化 胚胎干细胞或体细胞转染 阳性细胞筛选 阳性细胞提供核，进行去核卵母细胞核移植 胚胎体外培养至双细胞期 胚胎体内移植 产生克隆阳性个体 阳性个体的培育和建群,核移植法特点：,优点：可以进行基因定点的敲除和导入 后段工作相对简单 缺点：技术难度大 需要昂贵仪器,感谢：,感谢陈系古教授和马芸老师提供部分的图片!,Thanks！ 谢谢!,