微生物标本采集技术 临床微生物 环境微生物,感染办 张瑞芳,正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提,基本原则,1、及时采集微生物标本作病原学检查 2、在抗菌药物使用前采集标本 3、采样时严格执行无菌操作 4、采样后立即送检 5、棉拭子标本宜用运送培养基 6、标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂 7、送检标本时应注明来源和检验目的 8、混有正常菌群的标本，不可置肉汤培养,如何提高细菌阳性检出率,、标本采集时机 、标本采集方法 、标本的质与量 、标本的运送与保存 、镜检筛选合格标本 、高质量、多种分离培养基 培养环境,一、痰标本采集,关于咳痰标本 在抗菌素应用前采集标本 标本采集后12h内必须立即进行实验室处 理 痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 采集标本过程中要有专业的医务人员指导,使下呼吸道感染病原诊断成为难题, 细菌（包括防线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原体、衣原体与立克次体 原虫 寄生虫,痰标本采集自然咳痰标本 患者清晨起床后，用清水或冷开水反复漱口去除过量的口腔细菌，有假牙者应取下假牙 先轻咳，咳出口腔中的痰液弃去，再用力深咳，从气管咳出呼吸道深部的痰，直接吐入清洁、无菌的容器中 无痰可用3%-5%NaCI 5ml雾吸约5min导痰 也可用物理疗法。体位引流等法取痰,几种下呼吸道直接采集的标本, 经气管穿刺吸引 经胸壁针刺吸引 经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗 经支气管镜直接吸引 开胸肺活检 经人工气道吸引分泌物,痰标本采集吸痰 吸痰：无法咳痰或不合作者、人工气道者，戴好无菌手套，无菌集痰器分别连接吸引器和无菌吸痰管。按吸痰法将痰吸入无菌集痰器内，加盖送检 经支气管镜直接吸引： 注意严格无菌操作,二、尿标本的正确采集清洁中段尿标本,应保证尿液在膀胱内至少停留4h以上。最好留取早晨清洁中段尿标本 方法：患者睡前少饮水，清晨起床后先用肥皂水清洗会阴部，女性应用手分开大阴唇，男性上翻包皮，仔细清洗，再用清水冲洗尿道口周围；开始排尿，将前段尿排出，弃去，不要停顿，直接将中段尿10-20ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检。容器内是无菌的，所以打开容器盖后，应拿在手中，不要随意乱放。记录留取标本的时间，保证在留取标本后1小时内送至检验科,尿标本正确采集-留置导尿 消毒导尿管外部（接头上端近会阴部），按无菌操作方法用注射器穿刺导尿管吸取尿液10ml，操作时注意防止混入消毒剂（推荐用三步消毒法：75%酒精-2%碘酒-75%酒精脱碘待干） 注意不能从收集袋中采集尿液,三、血培养标本采集,1、手清洁：无明显污染使用速干手消毒液进行手卫生 2、血培养瓶口消毒：75%酒精消毒一遍，待干60s 3、静脉穿刺消毒：推荐用三步法 用75%酒精消毒采集部位 用2%碘酒从穿刺点向外画圆消毒，至消毒区域直径达5cm以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干 75%酒精脱碘：用75%酒精由内向外涂抹去碘酒液，待酒精挥发干燥后采血,操作注意事项：从静脉采血，不建议从动脉采血 用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头（如果行第二次穿刺，应换针头）直接注入消毒后的血培养瓶 血抽到培养瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固，立即送检，切勿冷藏！ 多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮肤菌丛污染的可能。除非无法作静脉穿刺取血，否则不应从留置导管内取血。 抽血前应将标签贴于血培养瓶颈上，标签内容包括病人基本信息、采血时间、采血部位。注意不要把标签贴在培养瓶条形码上，否则仪器无法识别。,血培养次数和采血时间,采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行，在患者发热期间越早越好，以发热高峰前1h内或病人寒战和发热开始时采集为宜。在10分钟内与不同部位采集外周血23份培养（有助于判断是污染还是感染，提高检出阳性率） 注意报阳时间，阳性瓶数。 在采取血培养后的2-5天内，不需要再重复采取血培养，因为进行治疗后的2-5天血液中的感染细菌不会马上消失。,四、对可疑中心静脉导管相关血流感染,1、保留导管 2、外周静脉血一份，中心静脉导管血1分，不用弃去导管起始部分的血液。 3、拔除导管： 4、2个外周静脉血、导管尖端5cm (在进行中心静脉导管血和周围静脉血培养时应记录报阳时间）,血管内导管尖段标本的采集、送检程序 用75%酒精清洁导管周围皮肤 无菌操作移动导管，剪取尖端末端5cm,直接置入无菌试管内或直接置入血平板内。 立即送检（不超过15min),防止干燥 如因怀疑CRBSI移除皮下埋置式静脉输液港，港内容物及导管尖端作定量培养。,血培养常见错误, 培养瓶放冰箱 瓶橡胶塞上小盖未打开直接穿刺 抽血后未及时混匀血液凝固,五、如何正确运送标本,1、运送培养基温度应适当 2、原则：保持细菌活力 3、血培养、脑脊液标本：应及时送检；不能及时送检的标本应置温箱或室温中，切不能放入冰箱中保存（除病毒、霉菌、分支杆菌培养样本置4) 4、痰、尿等标本：如不能及时送检可置冰箱，以抑制细菌生长，但时间不能超过6h.,六、各种标本储存的环境,标本采取后应该立即送检，如不能立即送检，储 存的环境要求： 储存环境标本来源4冰箱-痰、尿液、粪便、活检组织、气枪冲洗物、导尿管、心包积液、脓和伤口分泌物等 室温（25）-血液培养、脑脊液、泌尿生殖道、眼、耳、鼻、喉、血管导管尖、体液、厌氧菌培养标本。,美国的理念,1970年以前，美国的医院定期对空气和环境表面（如地面、墙壁、台面）进行培养。到了1970年，CDC和美国医院协会（AHA）主张停止对环境的常规培养，因为医院感染发生率与空气或环境表面中总的微生物污染水平不相关。且环境表面或空气中微生物含量的允许水平也没有有意义的标准。1970-1975年，美国有25%的医院减少了这种常规的环境培养工作-一个已经持续的趋势。,什么情况下要求进行环境采样,四种状况下要求进行环境采样： 一、是当环境中的宿主或媒介物被认为在疾病传播中有流行病学意义时，提供疾病或感染爆发的依据 二、是在研究过程中进行适当的环境采样 三、是为了监测潜在的危险环境条件，确认有害的化学或生物因素的存在，并验证危险因素的成功消除 四、是为了质量保证（QA）而采样，以评估改变感染控制措施取得的效果或是确保设施或系统按照规范或预期结果执行。,一、物体表面采样,物体表面细菌总数的检测评价 被污染程度 主要依据 消毒效果,物体表面采样-涂抹法,涂抹法：将5cm5cm的标准灭菌规格板，放在被检测物品表面，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在规格板内来回均匀涂抹整个方格，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入盛有10ml生理盐水的试管中，充分振摇1min,作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上进行计数，然后根据平板上菌落数得出物品表面每平方厘米的细菌数,物体表面采样-斑贴法,斑贴法：按无菌操作方法将5cm5cm的无菌滤纸用灭菌生理盐水浸湿，均匀贴附与物体表面，1min取下放入盛有25ml灭菌生理盐水试管中，充分振摇1min，作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上作菌落计数，同样得出物品表面每平方厘米的细菌数,二、消毒物品表面的监测：,1、采样时间：消毒处理后4小时内进行采样 2、采样面积：被采面积100平方厘米，取全部表面； 100平方厘米，取100平方厘米。 3、采样方法： 用5cm*5cm的标准灭菌规格板放在被检消毒物品表面，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ml)的棉拭子在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子投入王景洗脱液中，立即送检。 小型物体表面的结果计算用cfu/件表示。,物表监测结果范围,1、类、类环境：5cfu/cm2 2、类、类环境：10cfu/cm2 GB15982-2012 医院消毒卫生标准 4.1.1,三、手消毒效果监测,1、采样时间：在接触病人和从事 医疗活动前进行采样或消毒后立即 采样 2、采样面积及方法（棉拭方法） 被检人五指并拢，用含相应中和 剂无菌洗脱液（5ml)的棉拭子在双 手指,手监测标准范围,1、外科手消毒：5cfu/cm2 2、卫生手消毒：10cfu/cm2 GB15982-2012医院消毒卫生标准4.2,四、空气消毒效果监测,1、采样时间段：在消毒处理后，操作前进行采样 2、采样方法：按面积定数、打开、盖搭皿体边缘 3、采样高度：距地面1.5米（80-150） 4、布点方法：室内面积30，设内、中、外对角线三点; 室内面积30设4角及中央5点均距墙壁1米 5、收取方法：由外往里逐一收取，避免穿过培养皿从里往 外收取,1、监测时间：每季度一次 2、类环境、监测标准：洁净手术部(室)和其他洁净场所，空气中的细菌菌落总数要求应遵循G B50333-2013医院洁净手术部建筑技术规范3.0.2-2 3、类环境监、测标准：非洁净手术部(室)、产房、重症监护病房，空气中的细菌菌落总数4CFU(15min直径9cm平皿) 4、 类环境、监测标准：儿科病房、母婴同室、妇产科检查室、人流室、治疗室、换药室、消毒供应中心、血液透析中心(室)、急诊室、化验室、各类普通病房、感染疾病科门诊及其病房，空气中的细菌菌落总数4CFU(5min直径9cm平皿),G B50333-2013医院洁净手术部建筑技术规范3.0.2-2, 类环境：洁净手术室、 级： 级 手术区0.2cfu/30min. 90皿 周边区0.4cfu/30min. 90皿（100级）6号手术间 级 手术区0.75cfu/30min. 90皿 周边区1.5cfu/30min. 90皿 级 手术区2cfu/30min. 90皿 周边区4cfu/30min. 90皿（10000级）5号手术间 级6cfu/30min. 90皿,五、消毒液监测,1、采样方法：用无菌注射器按无菌操作方法:10ml培养基吸取1ml被检消毒液；5ml培养基吸取0.5ml被检消毒液，加入培养剂中混匀。 2、消毒液标准： 使用中灭菌用消毒液：无菌生长 使用中皮肤黏膜消毒液染菌量：10cfuml 其他使用中消毒液染菌量：100cfuml,消毒液监测标准范围,1、使用中灭菌剂：无菌生长 2、使用中皮肤黏膜消毒液：10cfu/ml 3、其他使用中消毒液：100cfu/ml,六、紫外线强调监测方法,1、日常记录：使用后进行消毒时间累积，使用超过1000小时的应加强监测或更换建立紫外线消毒使用登记本，每周用75%酒精擦拭灯管并记录 2、照射强调：普通30W直管型紫外线灯，新灯管的辐照强度90Wcm2为合格符合GB19258要求;使用中紫外线灯照射强度70Wcm2为合格； 3、强调监测：每半年一次监测前用75%酒精清洁灯管表面，开灯，待其稳定5分钟后，放置强度监测卡于灯管下垂直1米处，正面朝上，照射1分钟，取卡，读数。,4、注意事项：做好自身防护尤其是眼睛；检测卡要闭光保存。,七、高度危险性医疗器械,手术器械、穿刺针等：无菌生长 GB15982-2012医院消毒卫生标准4.3 不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查,八、中度危险性医疗器械：,呼吸机管路、口表等：20 cfu/件， 不得检出致病性微生物 每季度监测,九、低度危险性医疗器械,听诊器、血压计袖带等：20 cfu/件， 不得检出致病性微生物 每季度监测,十、消毒内镜,胃镜、肠镜等：20 cfu/件 WS507-2016软式内镜清洗消毒技术规范7.3 每季度监测,十一、透析用水,细菌：100cfu/ml