第2章 实验室检验技术结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。结核病细菌学检验主要包括4项基本技术，即涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定。检验人员应依据临床医师检验申请要求并结合实验室的设备和技术条件，负责对标本进行检验，及时、准确地填写检验报告。 近年来，国内、外研究者在分子生物学、分子微生物学及免疫学领域建立了若干快速、敏感、特异的检测新技术，为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来了新的希望。列入“规范”的结核杆菌临床基因扩增(PCR)检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学检测技术，因有多种试剂盒(试剂)及分析仪器可供选择，目前尚难制定统一的技术操作规范，故暂定为辅助操作技术。具备开展这些技术项目条件的实验室(或检验科)，须经有关主管部门批准后，严格按照相应技术所附的说明书与操作规程实施。 鉴于结核病实验室检查，特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施，制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病实验室的质量控制督导和培训。 第一节 结核茵检验实验室安全操作规则结核病细菌学实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室工作人员得到充分的防护，并避免造成环境污染。 1实验室应有合理布局及合适的单向(外排)通风体系。 2实验室应配备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等。 3实验室工作人员应按正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等。 4实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理。 5建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等。 6进行下列操作时应严格按照技术操作规范，防止产生细菌气溶胶：涂片制作；培养液的倾倒和转移；高速混合含菌液体；滴加、接种培养物；吸管稀释和混合菌悬液；取样器和振荡器的使用；细菌细胞超声粉碎；感染动物实验等。 第二节 标本的采集、运送和保存初诊患者应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。如无夜间痰，在留取清晨痰后23h再留取1份痰标本，或在送检时，留取2份即时痰。疗程中或复诊随访患者按期每次送检2份痰(清晨痰和夜间痰)。 一、痰标本的采集1即时痰为病人就诊时咳出的痰液；清晨痰为就诊当天清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前夜咳出的痰液。合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样痰液，痰量应为35ml。 2痰标本应由检验人员或经培训合格的专人验收，痰液不合格者，要求重新送检。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以便分析结果时参考。 3留取痰标本的容器应为广口、直径4cm、高2cm、有盖密闭的塑料盒或蜡纸盒，容器上应注明患者姓名、编号(门诊序号或患者登记号)及送检日期。 二、痰标本的保存和运送留取痰标本后，应将容器密封，切勿倒置，严防痰液外溢。需外送检查的标本应认真核对痰盒上的标注是否正确清晰，是否与检验单一致，痰容器应采用专用的冰盒，或以纸张和塑料袋封装、扎牢，顺序放置于包装袋内，注明盒盖向上的标示，严防运送途中倒置。当天不能检查的痰标本须置4冰箱保存。 三、其他标本的采集、运送和保存1尿液及胸、腹水标本留全量夜尿或胸、腹水，静置45h后，弃上清液，取沉淀部分至少10ml送检。 2大便、脓液、病灶组织或干酪块、脑脊液标本 应至少留取或采集23ml (g)，采集后立即送检。 3标本运送和保存可参考本节痰标本的保存和运送。 第三节 涂片检查法一、玻片的准备取经95乙醇擦拭脱脂的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于玻片背面的左端13处用玻璃笔编号。一张玻片只能涂抹一份痰标本，每张玻片只能使用 1次，不得清洗后再次用于抗酸染色检查。 二、直接涂片法1痰液及脓液用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分00501ml，于玻片正面的右侧23中央处均匀涂抹成2cm25cm椭圆形痰膜，自然干燥。 2病灶组织或干酪块先用组织研磨器磨碎后再行涂片。 3尿液及胸、腹水标本 留全量夜尿或胸、腹水，静置45h后，弃上清液，取沉淀部分约10ml，经60008000rmin(60008000rpm)离心20min，取沉渣涂片。 4脑脊液无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，薄膜形成后涂片。也可将脑脊液经60008000rmin离心20min，弃上清液，取沉淀物涂片。 5粪便标本与生理盐水混匀后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经60008000rmin离心20min，取沉淀涂片检查。 6咽喉棉拭子 棉拭子放入无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，并强烈振荡，取出棉拭子后，液体经60008000rmin离心20min后，取沉淀涂片检查。 三、集菌涂片法1漂浮集菌法 取深咳痰或1224h痰液经121高压灭菌15min，待冷却后，取510ml盛于容积为100ml的玻璃容器中(口径约2cm)，加灭菌蒸馏水20 30ml，总体积勿超过容器的13，加二甲苯03ml，放振荡器振荡10min，取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载物玻片盖于瓶口上，静置20min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。 2离心集茵法 取深咳痰或1224h痰液经121高压灭菌15min，待冷却后，取510ml盛于容积为500ml的离心管中，加水至50ml，经60008000r min离心20min后，取沉淀涂片检查。 四、染色、镜检方法(一)萋尔一尼尔逊抗酸染色法 萋尔一尼尔逊(ZiehlNeelsen)抗酸染色法，简称萋一尼氏染色法。 1染色液 染色剂08苯酚(石炭酸)复红溶液 脱色剂5盐酸乙醇液 复染剂03亚甲蓝溶液 2染色步骤 (1)涂片自然干燥后，火焰固定。 (2)滴加复红染色剂盖满痰膜，小心火焰加热，出现蒸汽后脱离火焰，保持染色 3min。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 (3)流水自玻片背面上端轻洗，洗去染色液。 (4)自痰膜上端外缘滴加脱色剂，流过痰膜，须脱至痰膜无可视红色为止。脱色应单片进行。 (5)流水自玻片背面上端轻洗，洗去脱色液。 (6)滴加亚甲蓝复染剂，染色30s。 (7)流水自玻片背面上端轻洗，洗去复染液。 (8)待干后镜检。 3镜检与报告 (1)用双目光学显微镜(目镜10，油镜100)镜检，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。 (2)按照下列标准报告镜检结果 抗酸杆菌阴性(一)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报抗酸杆菌数：18条抗酸杆菌300视野。 抗酸杆菌阳性(1+)：39条抗酸杆菌100视野。 抗酸杆菌阳性(2+)：19条抗酸杆菌10视野。 抗酸杆菌阳性(3+)：19条抗酸杆菌每视野。 抗酸杆菌阳性(4+)：10条抗酸杆菌每视野。 (二)荧光染色法 1染色液 (1)染色剂：01金胺“O”(Auramine O)溶液 (2)脱色剂：3盐酸乙醇液 (3)复染剂：05高锰酸钾水溶液 2染色步骤 (1)涂片自然干燥，经火焰固定。 (2)加染色剂1015min，水洗。 (3)加脱色剂12min至无黄色，水洗。 (4)加复染剂12min，水洗，待干镜检。 3镜检与报告 (1)在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。必须用40物镜确认菌体形态，应具有萋一尼氏抗酸染色镜检经验后，方可应用荧光染色法，荧光法难以确认时，应进行萋一尼染色检查，以免错判或漏判。荧光染色后涂片应在24h内检查，如须隔夜，置4保存，次日完成镜检。 (2)物镜20检查结果按下列标准报告 荧光染色抗酸杆菌阴性(一)：0条50视野。 报荧光染色抗酸杆菌数：19条50视野。 荧光染色抗酸杆菌(1+)：1099条50视野。 荧光染色抗酸杆菌(2+)：19条每视野。 荧光染色抗酸杆菌(3+)：1099条每视野。 荧光染色抗酸杆菌(4+)：100条每视野。 物镜40检查细菌细胞形态。 五、涂片检查法质量控制应建立室内、室间痰片检验质量控制制度。 室内质控应包括痰标本收集、痰片染色和镜检结果复验。室内质控应每季度进行1次，痰涂片应保存供上一级参比实验室(或质控机构)质量控制检查。 室间质控可定期进行，阳性痰涂片符合率应98，阴性痰涂片符合率应 96，(1+)以上的阳性片不允许出现假阴性。 六、废弃标本和污染物的处理痰盒和废弃标本等污染物，均须经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。 痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚烧不彻底或暴露焚烧是有害的。 痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作橱内进行痰涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以3苯酚(石炭酸)或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯(距离12m)照射 30min。 附录1：萋-尼氏染色试剂的配制 18苯酚复红染色剂 碱性复红乙醇贮存液(碱性复红8g，溶于95乙醇 100m1中)10ml，加5苯酚水溶液至100ml，混匀。 25盐酸乙醇脱色剂 浓盐酸5ml加95乙醇至100ml，混匀。 303亚甲蓝复染剂 亚甲蓝03g加95乙醇50ml待溶解后，加蒸馏水至100ml，混匀，即为贮存母液，使用时10倍稀释。 附录2：荧光染色试剂的配制 11金胺“O”染色液 金胺“O01g溶于95乙醇10ml内，加5苯酚至 100ml，混匀。 23盐酸乙醇脱色液浓盐酸3ml加95乙醇至100ml，混匀。 305高锰酸钾复染液05g高锰酸钾加蒸馏水至100ml，混匀。 第四节 分枝杆菌分离培养检查法分枝杆菌属(Mycobacterium)迄今报道有100多个种。伯杰系统细菌学手册将分枝杆菌菌种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很稀的新鲜培养物，在适宜培养温度下。7d以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(Mtuberculo sis)。在上述条件下，7d以内肉眼可见单个菌落，称为快速生长分枝杆菌。分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)及麻