饲料及饲料原料中玉米赤霉烯酮的快速筛查 胶体金快速定量法江西省地方标准编制说明一、标准制定意义（一）介绍玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。1962年Stob等首先从发霉的玉米中分离得到了该毒素，命名为玉米赤霉烯酮；1966年Urry首次阐明了该毒素的结构，并将此结构命名为F-2毒素，后又被改称为ZEN。ZEN为白色晶体，分子式C18H22O5，化学名为6-(10-羟基-6氧基-1-碳烯基)-雷琐酸-内酯6-(10-hydroxy-6-OXO-trans-1-undeceny)-resorcylicacid lactone，熔点164165，紫外线光谱最大吸收为236nm、274nm和316nm。红外线光谱最大吸收为970nm，其甲醇溶液在254nm短紫外光照射下呈明亮的绿-蓝色荧光。ZEN不溶于水，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、甲醇及乙醇等。在植物体内，ZEN主要代谢产生-玉米赤霉烯醇(-Zearalenol，a-ZOL)。在动物及人体内，除了可以代谢产生-ZOL外，ZEN还可代谢产生-玉米赤霉烯醇(-zearalenol，-ZOL)，-ZOL和-ZOL又可以相互转化并进一步代谢产生-玉米赤霉醇(zeranol，-zearalanol，ZAL)及-玉米赤霉醇(Taleranol，-Zearalanol，TAL)，而ZAL、TAL以及玉米赤霉醇(zearalanone，ZAN)又可相互转化。ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。Toshitsugu对19个国家和地区的谷物、食品及饲料中所含的ZEN进行了调查发现，包括中国、阿根廷、加拿大、波兰及也门等众多国家和地区的样品均有不同程度的污染。借助被污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，ZEN及其代谢产物可以进入人体，给人类的健康造成威胁。ZEN对动物及人类危害主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统、免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性。Schoental R在进行致癌试验时发现，试验组大鼠出现由致癌剂处理而诱发的肿瘤；此外，试验组和对照组大鼠还发生了乳腺纤维瘤、腺瘤、腺癌、垂体腺癌、睾丸间质肿瘤以及子宫纤维瘤等。在其他致癌试验中也有类似情况发生，这些肿瘤所涉及的器官表明，它们可能与动物饲料中的雌激素物质有关。因此认为，它们是由污染饲料的ZEN或其代谢产物引起的。（二）背景据联合国粮农组织（FAO）统计，全世界每年谷物产量的25%受到真菌毒素不同程度的污染。随着饲料工业的快速发展，近年来，中国的饲料也受到霉菌污染的严重挑战。自2006年以来，玉米等饲料原料价格普遍上涨，致使很多饲料企业及养殖户使用低质饲料原料，加上近年来气候的变化，华北、东北地区降雨量增加，进一步加重了饲料原料中真菌毒素的污染。而由于饲料原料和配合饲料中多种真菌毒素同时存在，在食用油等产品及牛奶中真菌毒素污染也比较严重。在世界许多地方，目前真菌毒素已构成重要的食品安全问题。真菌毒素对人类和动物健康可产生严重的影响，这一认识导致了许多国家在近几十年来制定了诸多有关食品和饲料中真菌毒素的法规，以保护人类的健康，并保障生产者和贸易商的经济利益。随着全球经济一体化的进程，类似真菌毒素等涉及安全卫生项目的限量标准，越来越多地被利用为贸易保护主义中非关税壁垒的重要手段。因此，为了保证食品安全，保障消费者的健康，为了打破国外的技术壁垒，同时在合理有利的前提下，更多地树立我国的技术性壁垒，开展饲料中真菌毒素的检测并建立标准方法是有效的方法之一。目前国内应用标准检测方法大多为仪器方法，所需仪器设备昂贵，不利于进行广泛推广，并且限制了很多检测单位高效、广泛地开展检测工作。建立符合中国国情的快速检测方法标准，具有检测快速、简便、灵敏、成本低等优点，为打开市场并占领市场提供了先决条件。（三）限量标准、检测方法及研究现状1、限量标准目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.05mg/kg；意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.1mg/kg；而在法国，植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于0.2mg/kg。中国则规定饲料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超过500g/kg。表1 我国饲料中的玉米赤霉烯酮限量标准产品名称限量/(g/kg)配合饲料、玉米5002、检测方法及研究现状玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)。TLC法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。而ELISA法测定结果受试剂盒差异、实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大，重复性差，假阳性率高，难以达到相关技术要求。常规的HPLC法虽然比TLC灵敏度高，但由于样品前处理手续繁琐，操作复杂，也难以推广。以上几种方法均耗时较长，而随着商品经济的发展，人们对时间概念的加强，无论是商家还是政府部门对检测时间的要求越来越高，而胶体金试纸条作为一种快速检测技术，能很好地解决这个问题，提高检测效率，缩减检测时间。（四）制定标准的必要性和意义1、提高农产品质量的需要玉米赤霉烯酮是由产毒真菌产生的代谢物，广泛存在于粮油食品和饲料中。这些产毒真菌分布于各级食物链，即使是在现今拥有先进的农业技术和食品加工工艺的条件下，在作物种植、收获、储藏和加工过程中，仍然无法避免和防止产毒真菌的危害。随着我国经济快速发展，人民群众物质文化生活水平不断提高，对食品安全的关注进一步提高，迫切需要相应的检测技术，鉴于传统检测方法的专业性要求高和成本昂贵的缺点，玉米赤霉烯酮快速检测技术的研究及制订相应的检测方法标准是非常必要的。2、实现以人为本，保证广大群众生命健康的需要玉米赤霉烯酮毒性很高，可通过污染谷物和那些来源于被玉米赤霉烯酮污染了的饲料喂饲的动物性食物（如牛奶、肉和蛋）而进入食物链，危害人类健康。其具有致突变、致癌性，还具有免疫毒性，其作用的靶器官主要为肝脏，可引起人类和动物的肝脏病变和致癌。为了对国家、人民高度负责，保障人民生命安全和农村社会稳定，研究玉米赤霉烯酮快速检测技术并制订相应的检测方法标准是非常必要的。3、适应市场经济和加入WTO新形势的需要我国已经加入WTO，我国农产品已面临国际和国内两个市场，为我国农产品（劳动密集型）进入国际市场提供了很好的机遇，但国际上十分重视农产品的安全问题，而农产品易于被真菌污染，可能存在玉米赤霉烯酮等真菌毒素残留问题，这已成为影响出口创汇的最大制约因素。由于毒素残留超标，引起外国拒收，退货、扣留、索赔、撤消合同等事件经常发生，给我国农产品生产者造成很大损失，并影响了我国农产品的形象。为了从源头保证农产品质量，提高我国农产品的竞争力，研究玉米赤霉烯酮快速检测技术并制订相应的检测方法标准是非常必要的。二、标准制定过程饲料原料中玉米赤霉烯酮的快速筛查 胶体金免疫层析法标准由江西省兽药饲料监察所、北京勤邦生物技术有限公司、双胞胎（集团）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司负责起草编写。根据国家有关标准制定和修订工作的要求，标准起草单位在饲料原料中玉米赤霉烯酮的快速筛查 胶体金免疫层析法的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已将玉米赤霉烯酮与1,3-丙二胺反应得到具有氨基官能团的半抗原；将玉米赤霉烯酮半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得玉米赤霉烯酮单克隆抗体；建立了胶体金免疫层析法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）开展多种饲料原料胶体金快速检测方法的试验，包括小麦、大米、黄豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出饲料原料中玉米赤霉烯酮的含量。如：方法的灵敏度，按照空白饲料原料样品及25g/kg、50g/kg、100g/kg、200g/kg四种浓度对饲料原料进行添加，确定检测限；方法的准确率，通过对经验证的阴阳性样品进行检测，得到本检测方法的假阴性率和假阳性率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠；方法的特异性，运用本方法对饲料原料中常见的其他真菌毒素进行检测，确保本方法能特异性地检测饲料原料中玉米赤霉烯酮残留。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。三、标准制定依据本标准是根据GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写、GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第4部分：试验方法标准的要求而进行编写的。有关技术内容是在参考国外有关标准及文献的基础上经研究、改进和验证后制定的。四、标准技术内容和技术指标的论证（一）技术原理本方法应用了竞争抑制免疫层析原理。将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显示出来。样本中的玉米赤霉烯酮在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上玉米赤霉烯酮-BSA偶联物的结合，使检测线不显颜色，结果为阳牲；反之，检测线显红色，结果为阴性。（二）胶体金免疫方法主要材料的制备1、半抗原的合成及鉴定玉米赤霉烯酮为小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，因此需要与大分子共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体，本实验首先需要合成小分子半抗原与蛋白质偶联的人工抗原。玉米赤霉烯酮小分子半抗原的制备既要保留其基本结构特征，同时又要很好地与大分子蛋白结合。本项目通过玉米赤霉烯酮小分子结构改造获得具有氨基官能团的半抗原，与牛血清白蛋白（BSA）偶联合成免疫原，与卵清蛋白（OVA）偶联合成包被原。将玉米赤霉烯酮与1,3-丙二胺反应得到具有氨基官能团的半抗原，合成路线如下：取玉米赤酶烯酮32mg，1,3-丙二胺0.1mL及少量4-二甲氨基吡啶加入5mL干燥的二甲基甲酰胺中，作为A液；取N,N-二环己基碳二亚胺40mg溶解于1mL干燥的二甲基甲酰胺，作为B液；0条件下缓慢滴加B液于A液中，滴加完毕后自然升温至室温，继续反应24h。蒸除溶剂，柱层析纯化后得到羧丙基玉米赤霉烯酮，即为玉米赤霉烯酮半抗原。2、人工抗原的合成及鉴定（1）免疫原的合成将玉米赤霉烯酮半抗原与BSA进行偶联得到免疫原。具体操作如下：取7mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；取戊二醛水溶液0.1mL，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取BSA 30mg，使之充分溶解在2.7mL 0.1mol/L CB（pH 9.6）中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24h，用5mol/L的硼氢化钠水溶液0.2mL进行还原反应4h，用0.01mol/L PBS 4透析3d，每天换透析液3次，得到玉米赤霉烯酮免疫原。（2）包被原的合成将玉米赤霉烯酮半抗原与OVA进行偶联得到包被