第三军医大学 硕士学位论文 鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化的防治作用及其机制研究 姓名：艾志波 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合临床 指导教师：张荣华 2011-05 第三军医大学硕士学位论文 7 鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化的防治作用及其机制研究 摘 要 目的： 肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程，是慢性肝病发展到肝硬 化的必经病理阶段，防治肝纤维化是攻克肝硬化的突破口，从中医药中寻求有效的治 疗方法具有重要意义。转化生长因子（transforming growth factor beta，TGF-）是 一类调节细胞生长和分化的多肽，具有活化肝星型细胞（hepatic stellate cells，HSC） ， 促进肝脏胶原基因表达，促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成等作用， 是最重要的促肝纤维化因子之一。采用四氯化碳（carbon tetrachloride4，CCl4）诱导大 鼠肝纤维化模型，观察鳖甲煎改良方对大鼠肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）的防治作 用及对 TGF-1、smad3 和 smad7 蛋白及 mRNA 表达情况，探讨其抗肝纤维化分子机 制。 方法： 1肝纤维化模型制备： SD 雄性大鼠 90 只，随机取 10 只作为正常对照组（A） ， 其余大鼠用皮下注射 40%四氯化碳 （CCl4） 橄榄油油剂 0.3mL/100g 诱导大鼠肝纤维化 模型 8 周，于第 2 周时随机处死 5 只证实 HF 形成后随机分为肝纤维化模型组（B） 、 鳖甲煎改良方高剂量组（C）28.4g/（kgd） 、中剂量组（D）14.2g/（kgd） 、低剂量组 （E）7.1g/（kgd） 、复方鳖甲软肝片对照组（F）0.6g/（kgd） ，每组 15 只。鳖甲煎 改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组给予 1 mL/（100 gd）相应药液灌胃治 疗，A、B 组同时给予等剂量的生理盐水灌胃处理。 2标本收集及处理： 8 周后各组大鼠在 3%戊巴比妥钠以 1ml/kg 体重腹腔注射 麻醉，经股动脉采血测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT） 、天 门冬氨酸转移酶（aspartate aminotransferase，AST） 、白蛋白（albumin）和球蛋白 （globulin）含量；并取同一部位肝组织用 10%中性福尔马林固定，24 小时后逐级酒 精脱水，二甲苯透明，包埋、切片，作 HE（hematoxylin-eosin）染色观察肝纤维化程 度变化并且运用免疫组化方法分析转化生长因子1（transforming growth factor beta one，TGF-1） 、Smad3 及 Smad7 表达；取肝右叶组织二块放入液氮罐中保存用以提取 组织 RNA 及蛋白质。 第三军医大学硕士学位论文 8 3主要观测指标与方法： 试验中每天观察大鼠一般情况并称重，应用 EX7 全自 动生化测定仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT） ，天门冬氨酸氨基转移酶（AST） 、 白蛋白、 球蛋白含量； HE 染色观察肝纤维化程度， reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）检测其转化生长因子 TGF-1、受体、受体、Smad3 及 Smad7mRNA 基因表达变化，免疫组织化学方法和 Western-blot 方法检测各组组织中 TGF-1、smad3 和 smad7 蛋白表达。 结果： 18 周后，成功复制大鼠肝纤维化模型，模型组肝纤维化形成明显，肝小叶结构 破坏，肝组织中胶原纤维含量和沉积明显增加。与模型组比较，鳖甲煎改良方高、中、 低剂量组和复方鳖甲软肝片组肝小叶结构破坏明显减轻，肝纤维化程度分级较模型组 明显好转，胶原纤维所占面积显著缩小（23、24、24、26 vs 50） ；模型组、鳖甲煎改 良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组 ALT 和 AST 含量显著高于正常对照组 （P0.01）且模型组最高，显著高于其他各组（P0.01） ，白蛋白含量则明显低于正常 对照组（P0.01） ，模型组更低于其他各组（P0.01） ；鳖甲煎改良方高、中、低剂量 组间比较无统计学意义，但与复方鳖甲软肝片组比较有显著差异（P0.01） ；各组球蛋 白含量比较均无显著性差异。 2. RT-PCR 结果显示，正常组大鼠肝组织三种基因都有较低水平的表达，而模型 组大鼠肝组织 TGF-1、Smad3 mRNA 表达显著增强，smad7 表达明显减弱，与模型组 比较， 鳖甲煎改良方高、 中、 低剂量组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织 TGF-1、 Smad3 表达减少 （TGF-1： 0.32300.0039、 0.32750.0057、 0.32320.0035、 0.36650.0158 vs0.87610.0140；Smad3：0.10270.0043、0.09350.0046、0.10250.0019、0.1257 0.0030 vs0.81050.0070） ，smad7 表达明显增强（0.51000.0009、0.50990.0070、 0.50930.0023、0.49790.0093 vs 0.11660.0128） 。 2 免疫组化及 Western- blot 结果显示， 正常组大鼠肝组织有较少 TGF-1、 smad3 和 smad7 表达，模型组大鼠肝组织 TGF-1、Smad3 蛋白表达明显增强，而 smad7 表 达明显减弱；与模型组相比，鳖甲煎改良方各浓度组与复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织 TGF-1、Smad3 表达显著减少（Western- blot：TGF-1：0.1270.014、0.1220.051、 0.1260.027、0.1190.020vs0.3320.074，P0.01；Smad3：0.4150.057、0.427 0.074、0.4250.080、0.4320.075vs0.5270.054，P0.01） ，smad7 蛋白的表达明显 增加（Western- blot：0.3080.077、0.3260.086、0.3150.071、0.3480.065vs 0.185 0.059，P0.01） ，且鳖甲煎改良方高、中、低剂量组和复方鳖甲软肝片组间疗效比 第三军医大学硕士学位论文 9 较无明显差异。 结论： 鳖甲煎改良方能够显著减轻 CCl4导致的大鼠肝纤维化程度， 减少胶原纤维沉积和 防止肝小叶结构破坏，显著改善大鼠肝功能，尤其降低丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨 酸氨基转移酶含量，并且能够明显抑制大鼠肝组织中 TGF-1 和 Smad3 mRNA 基因表 达，显著增加 smad7 mRNA 基因表达，下调 TGF-1 和 Smad3 蛋白在组织表达，显著 升高 smad7 蛋白表达。 关键词： 鳖甲煎改良方；肝纤维化；TGF-1；smad3；smad7 第三军医大学硕士学位论文 3 The effects and mechanism study of Modified Prescriptions with Turtle Shell Decoction on hepatic fibrosis in rats. Abstract AIM: Liver fibrosis is a common pathological process of cirrhosis in the development of a variety of chronic liver disease as well as a necessary development to the pathological stage of cirrhosis, so it is the key point to conquer cirrhosis from preventing liver fibrosis. It is very important to seek effective treatment method from tradional Chinese medicine to prevent and cure liver fibrosis. Transforming growth factor- (TGF-) is peptides regulating the growth and differentiation of cells, also activating hepatic stellate cells (HSC), promoting liver collagen gene expression and promote extracellular matrix (ECM) synthesis and so on. It is the most important factor in promoting liver fibrosis. In this research the effects of Modified Prescriptions with Turtle Shell Decoction (MPTSD) on the expression of TGF-1, smad3, smad7 in experimental hepatic fibrosis of CCl4-induced rats have been studied, exploring its anti-fibrosis molecular mechanism. METHODS: 1. The duplication of model with hepatic fibrosis: Ninety SD adult rats were used in this study, 10 of which were randomly selected as normal controls (A), and the rest were used to replicate hepatic fibrosis model by multiple subcutaneous injections of 0.3mL/100g 40% carbon tetrachloride4 (CCl4) for 8 wk. At the second week, five rats were executed to confirm the formation of liver fibrosis, and then the rest of rats were randomly divided into the pathological model group (B), MPTSD high-dose group (C) 28.4g/(kgd), MPTSD medium-dose group(D) 14.2g/(kgd), MPTSD low-dose group(E)7.1g/(kgd) and Fufang- Biejia Ruangan Tablet-treated group(F)0.6g/(kgd), there were 15 rats in every group, at the same time, intragastric administrated with C, D, E, F the same volume 1ml/(100gd), whereas the rats in group A and B were treated with physiological saline also the same volume. 2. Sample collecti