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荧光定量PCR步骤一土壤基因组DNA提取(一)试剂和仪器:1. 乙醇(96%-100%)2. 异丙醇3. 离心机4. 漩涡振荡器5. 水浴锅6. 电子天平7. 超净工作台8. 1000ul、100ul移液枪;灭菌枪头9. 1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管10. 称量纸、称量勺、滤纸、酒精棉球、镊子等(二)提取步骤(OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit):提取前准备工作:按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer。1. 打开水浴锅预热70(70预热Elution Buffer),用1.5ml离心管,取0.5g土壤,加入0.5g玻璃珠,加入1ml Buffer SLX MLus,立即在涡旋仪上最高速涡旋3min,使菌体进入溶液(豆粕的改为:打开水浴锅预热70,取3g豆粕到50mL离心管中,加入27mL水,3000rpm离心5min,重复3次各取4mL上清到5mL离心管,13000rpm离心2min,弃上清,加0.5g玻璃珠,加1mL Buffer SLX MLus,立即在涡旋仪上最高速涡旋3min,使菌体进入溶液);2. 加入100ul Buffer DS,涡旋混匀;3. 转移至预热至70水浴锅中水浴10min,水浴过程中轻轻翻转一次(若存在较难溶解的细菌,水浴温度可增加到90),使菌体裂解;4. 3,000 rpm室温离心3min,转移800ul上清液到新的2ml离心管中,并加入270ul Buffer SP2涡旋混匀;(离心时准备冰盒)5. 置于冰中5min,13,000 xrpm、4离心5min(配平);6. 在超净台中把上清液转称至新的2ml离心管中,加入0.7倍(749ul)的异丙醇,翻转混匀20-30次,把样品置于-20 1h;7. 13,000 rpm、4离心10min,沉淀DNA(可能看不到沉淀);8. 倒弃上清液,并反扣于吸水纸上1min, 若还有残留,则在超净台中用移液器吸去;9. 加入70预热的200 ul Elution Buffer,涡旋10s,65水浴15min,让DNA充分溶解(如果想得到不含RNA的DNA,在这一步向样品中加10ul 25mg/mL的RNA酶A);10. 用剪过的黄枪头加入50ul HTR Reagent(使用前充分摇匀),漩涡混合10s;11. 置于室温2min,13,000 rpm离心2min, 使HTR Reagent沉降;12. 转移上清液至新的2ml离心管(若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色,重复步骤10-12);13. 加入与上清液等体积(约200ul)XP2 Buffer, 漩涡震荡充分混匀;14. 将上步所得溶液加到吸附柱(柱子套在2ml收集管中),12,000 rpm 室温离心1min,弃上清液,保留收集管;15. 柱子重新套在上步收集管中,加入300ul XP2 Buffer,12,000 rpm 室温离心1min,弃上清液和收集管;16. 柱子套在新的2ml收集管中,加入700ul SPW Wash Buffer(经乙醇稀释),12,000 rpm室温离心1min,弃上清液,保留收集管;17. 柱子重新套在上步收集管中,重复步骤16;18. 柱子重新套在上步收集管中,13,000 x g 室温空离2min,使吸附柱干燥(空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对去除乙醇残余至关重要,乙醇残留可能会影响下游酶的使用);19. 把柱子置于新的1.5ml离心管,枪头不要碰触吸附柱,垂直悬空加加30ul Elution Buffer至吸附柱中央,65水浴15min, 13,000 x g离心1min,洗提回收DNA;20. 换个1.5ml离心管,重复上步(不需要水浴);21. 将两次得到的DNA溶液合并后再分装两管,每个30ul,一个放4常用,另一个-20低温储存。22. 用微量之外分光光度计测定提取的DNA浓度,OD260/OD280约为1.8左右,过低有蛋白质和酚污染,过高有RNA存在。二琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA产物(1%琼脂糖凝胶)(一)试剂和仪器1. EDTA、NaOH、Tris、乙酸2. EB3. 琼脂糖4. 10ul移液枪5. 电泳槽6. 电泳成像系统(二)药液配制1. 50TAE缓冲液(pH8.3):称取Tris 242g,Na2EDTA2H2O 37.2g,向烧杯中加800ml的去离子水,充分搅拌溶解;加入57.1mL乙酸,使用去离子水定容至1L,高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液:例如需要使用200ml的1*TAE,则量4ml的50*TAE,196ml的去离子水,混匀即可。(三)步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用60ml,小胶用30ml): 称取0.6g(0.3g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml(30ml)1TAE,该上盖子。微波炉加热煮沸,煮沸后转两圈取出摇匀,重复一次,至琼脂糖全部融化,摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60,加入6ul(3ul)EB,摇匀,倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层,若有气泡需赶走气泡,插好梳子,室温下静置直至凝胶完全凝固(20min左右)。2. 垂直轻拔梳子,将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极(黑色)处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。3. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker;取样品3ul,与2ul Loading buffer在点样板或PE手套上混合,用分别将样品加入凝胶槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序)。4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压120V,时间20min,n=1-1。样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。5. 观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出荧光条带,凝胶成像系统拍照保存。三、普通PCR扩增(一)耐药基因的特异性引物如表1如示(由北京奥科公司合成)表1耐药基因的引物序列目标基因引物引物序列(5-3)目标片段大小(bp)参考文献ermBermB-91fGATACCGTTTACGAAATTGG364Chen et al, (2007)ermB-454rGAATCGAGACTTGAGTGTGCermFermB-189fCGACACAGCTTTGGTTGAAC309Chen et al, (2007)ermB-497rGGACCTACCTCATAGACAAGermTermB-52fCATATAAATGAAATTTTGAG369Chen et al, (2007)ermB-420rACGATTTGTAT TAGCAACC(二)耐药基因的PCR扩增反应体系均为25L(表2),表2耐药基因的PCR扩增反应体系组分(L)ermBermFermT2Mix12.5012.5012.50上游引物(10M)0.500.500.5下游引物(10M)0.500.500.5DNA模板1.001.001.00灭菌超纯水10.5010.5010.50(三)各基因的PCR扩增反应条件如表3所示。表3耐药基因的PCR扩增反应程序步骤ermBermFermT1预变性94,240s94,240s94,240s2变性94,45s94,45s94,30s3复性(退火)58,45s56,45s49,30s4延伸72,45s72,45s72,45s5循环数(24步骤)(次)3535356再延伸72,360s72,360s72,360s7保存4,1h4,1h4,1h四琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(2%琼脂糖凝胶)(一)试剂和仪器7. EDTA、NaOH、Tris、乙酸8. EB9. 琼脂糖10. 10ul移液枪11. 电泳槽12. 电泳成像系统(二)药液配制1. 50TAE缓冲液(pH8.3):称取Tris 242g,Na2EDTA2H2O 37.2g,向烧杯中加800ml的去离子水,充分搅拌溶解;加入57.1mL乙酸,使用去离子水定容至1L,高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液:例如需要使用200ml的1*TAE,则量4ml的50*TAE,196ml的去离子水,混匀即可。(三)步骤6. 制备2%琼脂糖凝胶(大胶用60ml,小胶用30ml):称取1.2g(0.6g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml(30ml)1TAE,该上盖子。微波炉加热煮沸,煮沸后转两圈取出摇匀,重复一次,至琼脂糖全部融化,摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60,加入6ul(3ul)EB,摇匀,倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层,若有气泡需赶走气泡,插好梳子,室温下静置直至凝胶完全凝固(20min左右)。7. 垂直轻拔梳子,将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极(黑色)处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。8. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker;取样品5ul用分别将样品加入凝胶槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序)。9. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压120V,时间20min,n=1-1。样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。10. 观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存。11. 若有目的条带则将PCR产物(剩余PCR产物20ul左右,上游引物10ul或上下游引物各10ul)送至北京奥科公司进行测序,根据测得的序列在NCBI上进行同源性比对,同源性应大于98%,判断是否为目的耐药基因。五胶回收(一)试剂和仪器:1.乙醇(96%-100%)3.离心机5.水浴锅8.移液枪;灭菌枪头9.1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管 (二)提取步骤(OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit): 提取前准备工作:A.按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer;B.调节水浴的温度为50-55;C.65预热的Elution Buffer。1. (普通PCR反映体系为25ul,需要两管,共50ul,插大梳子,用1.52的胶,将两管全打入一个孔)琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,推荐使用新鲜的TAE/ TBE Buffer和新配制的胶。2. 片段完全分离后,在紫外灯下迅速切取所需条带,DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s,。 3. 切取下来的胶放入1.5ml的离心管,按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer(XP2)对应量,即胶与XP2以1:1体积混合(一般将凝胶全部淹没即可),50-55水浴至凝胶完全溶解(约7min)。每隔2-3mi n翻转一次。注意: 当pH8,DNA会明显降解。当Binding Buffer完全溶解凝胶后,请注意溶液颜色的变化。如果溶液颜色已经变成紫色或红色,必须加入5ul 5M NaAc, pH5.2至溶
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