基因工程原理与技术基因工程原理与技术 The Principles & Technology of Genetic Engineering 张 金 文 甘肃农业大学农学院 2010年3月 2 绪言 随着生物科学和生物技术的日益发展，人们越来越重视对生物学研 究手段的了解和掌握。 基因工程原理和技术是为硕士研究生设置的一门课程，是分子生物 学系列课程中的重要环节。 基因工程原理与技术是一门直接利用分子生物学基础知识指导分子 生物学实验操作的理论与实践相结合的课程。 3 基 本 内 容 本课程以基因克隆为主线，重点介绍与此相关的: ?载体 ?工具酶 ?文库的构建与筛选 ?遗传转化方法 ?基因分析的各种手段 本课程涵盖面广，几乎涉及生物学的所有领域，学 习本课程之前，要求具备生物学、生物化学和分子生物 学的基础知识。 分子杂交 PCR 核苷酸序列分析 基因改造 4 本课程重点本课程重点 介绍在核酸水平上进行各种操作的: 基本原理 技术步骤 希望通过对基础原理的认识，能够理解和掌握实践中具体 操作的原理和步骤，并能自主选择或设计相关的实验方 法。 本课程讲授的PowerPoint演示文稿，主要参考: 分子克隆实验指南(第三版） （萨姆布鲁克斯 等） 基因工程原理（吴乃虎，上、下册） 植物基因工程原理与技术（王关林） Gene 由于水平有限，时间紧迫，讲授中可能出现不详或错误之处，敬请 批评指正和原谅。 5 第一章绪 论 第一节 基因工程的基本概念 第二节 基因工程的诞生与发展 第三节 基因工程的主要研究内容 第四节 基因工程问世后的社会 反应及生物安全性 6 第一节 基因工程的概念第一节 基因工程的概念 基因工程（genetic engineering）是现代生物技术的重要组成部 分，是现代生物技术的核心。它是20世纪70年代初发展起来的 一门新兴技术学科，这一技术的兴起标志着现代遗传学已进入 定向控制遗传性状的新阶段。 一般认为，遗传工程是按照人们预先设计的蓝图，将一种生物 的遗传物质绕过有性繁殖导入另一种生物中去，使其获得新的 遗传性状，甚至形成新的生物类型的遗传操作（genetic manipulation）。 遗传工程又分 广义 和 狭义 之分，广义的遗传工程包括细胞 工程和基因工程；狭义的遗传工程就是基因工程。 7 基 因 工 程 概念：概念：基因工程是在分子水平上进行的遗传操作。指将 一种或多种生物体（供体）的基因、基因组提取出来， 或者人工合成的基因，按照人们的愿望，进行严密的设 计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体） 的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状 的技术。 基因工程是在分子水平上进行的遗传操作。指将 一种或多种生物体（供体）的基因、基因组提取出来， 或者人工合成的基因，按照人们的愿望，进行严密的设 计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体） 的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状 的技术。 由于被转移的基因一般须与载体DNA重组后才能实 现转移，因此，供体、受体和载体称为基因工程的三 大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于 外源基因。 8 除了少数RNA病毒外，几乎所有生物的基因都存在于DNA结构 中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，所以基因 工程也叫重组DNA技术（recombinant DNA technology）。 另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基 因工程称为分子克隆（molecular cloning）或基因的无性繁殖。 目前各种文献中经常出现的相关名词有： 遗传工程（genetic engineering) 基因工程 （gene engineering) 基因操作（gene manipulation） 重组DNA技术（recombinant DNA techniques) 分子克隆（molecular cloning) 基因克隆（gene cloning） 它们在具体内容上彼此相关，许多情况下混用。 基 因 工 程 9 基因工程的特点 基因工程技术打破了物种的界限，使世间流传的神话 与科幻（骡子生出小马驹，鸡窝里飞出金凤凰）变成了 可能。 带有不同抗性品质且具丰富特殊营养成分的转基因农 作物，能够分泌药用活性物质的转基因羊的成功，特别 是1997年多利羊的出生，又为高等生物的无性繁殖提供 了范例，也为clone(克隆)一词的内含补充了新的内容。 基因工程具有两个明显的优势特征： (1)反向生物学的研究方法，促进了以应用性成果的不 断涌现为特点的科技进步。 (2)工程的同性，它的科学研究成果可转化为生产力， 直接为人类创造财富或解决人类自身的实际问题。 10 基因工程技术的特点 传统的育种方法只能通过有性杂交获得动植物新品种，但是由于生 殖隔离的制约，有性杂交只能在物种内进行，远缘杂交受到很大 限制。 基于生物界遗传密码的通用性和碱基配对的一致性，这就有可能用 基因工程技术，实现物种间的基因交流，创造出用传统方法无法 实现的生物类型。 基因工程最突出的特点是：基因工程最突出的特点是：基因工程最突出的特点是：基因工程最突出的特点是： 打破常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与 真核生物之间、动物与植物之间、及人与其他生物之间的遗传 信息进行重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌、植物、 及其他动物中表达，动物的基因也可以转移到植物中表达。 11 第二节 基因工程的诞生与发展 基因的染色体遗传学阶段在20世纪50年代以前，从细 胞染色体水平上研究基因。 基因的分子生物学阶段在20世纪50年代以后，当 Watson和Crick的DNA双螺旋结构的发现，从DNA大分子 水平上研究基因。 基因的反向生物学阶段在20世纪70年代，随着以DNA 重组为中心的基因工程学的不断完善，人们改变了从表 型到基因型的传统研究基因的途径，而能够直接从克隆 目的基因出发，研究基因的功能及其与表型间的关系。 基因研究经历了三个不同的发展阶段! 12 基因工程诞生 1973年，斯坦福大学的Cohen和Boyer将编码有卡那霉素(kanamycin)抗 性基因的E.coliR6-5质粒DNA和编码有四环素(tetracycline)抗性基因 的另一种E.coli质粒pSCl01 DNA混合后，加入EcoRI进行消化切割， 再用T4 DNA连接酶将它们连接成重组的杂合DNA分子。将这种杂 合的质粒DNA分子转入E.coli进行无性繁殖，发现某些转化小菌落 表现出既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特征。这是人类第一次 体外成功地获得杂合DNA分子，并使之在E.coli中得以表达的事 例。 对基因工程诞生起了决定作用是现代分子生物学领域的 理论上的三大发现 技术上的三大发明 现在人们公认，基因工程诞生于1973 年 1973 年。 13 基因工程诞生的理论和技术支撑 理论上的三大发现理论上的三大发现 DNA是生物的遗传物质。 DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 遗传密码和遗传信息传递方式 技术上的三大发明技术上的三大发明 限制性内切酶的发现与DNA的切割 DNA连接酶的发现与DNA片段的连接 基因工程载体的研究与应用 14 基因工程的发展历史 基因工程诞生的理论基础 1. 20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是 DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础（美国Avery的 肺炎链球菌转化实验和冷泉港卡内基遗传学实验室Hershey和他的 学生Chase用放射性同位素32P和35S分别标记T2噬菌体的内部DNA 和外壳蛋白实验） 2. 在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理， 解决了基因的自我复制和传递的问题（Watson和Crick，1958）； 3. 在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学 说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表 达问题。 15 基因工程诞生的关键技术 20世纪70年代中期，两项关键技术问世 （I）DNA分子的体外切割与连接技术 核酸内切酶和DNA连接酶核酸内切酶和DNA连接酶 （II）DNA分子的核苷酸序列分析技术 F.Sanger以及A.Maxam和W.Gilbert发明了快速的DNA序列测定 技术双脱氧终止法、化学降解法及其计算机的应用。 此外，基因导入技术和受体的开发对基因工程的创立也具有 重要的意义。 ?作用 （1）单基因分离；（2）基因克隆载体（Vector）构 建；（3）外源基因在受体细胞中表达 16 基因与基因工程研究的历史年表(1) 17 基因与基因工程研究的历史年表(2) 18 基因工程研究的大事件 19 第三节基因工程的主要研究内容 一、 基础研究一、 基础研究 ?构建一系列克隆载体和相应的表达系统 ?建立不同物种的基因组文库和cDNA文库 ?开发新的工具酶 ?探索新的基因工程新技术、新的操作方法等。 各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技 术不断趋向成熟。 20 (1)基因工程克隆载体的研究(1)基因工程克隆载体的研究 构建克隆载体是基因工程技术的中心环节，因为基因工程的发展 与克隆载体的构建密切相关。 最早构建和发展的用于原核生物的克隆载体，促进了原核生物为 对象的基因工程研究的迅速发展。 Ti质粒的发现及Ti质粒衍生的克隆载体的成功构建，使植物基因 工程研究随之得到迅速发展。 动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究取得进展。 至今虽已构建了数以千计的克隆载体，但是构建新的克隆载体仍 是今后研究的重要内容之一，尤其是构建适合用于高等动植物转 基因的表达载体和定位整合载体。 21 （2)目的基因研究（2)目的基因研究 基因是一种资源，而且是一种有限的战略性资源。因 此开发基因资源已成为发达国家之间激烈竞争的焦点 之一，谁拥有基因专利多，谁就在基因工程领域占主 导地位。 基因工程研究的基本任务是开发人们特殊需要的基因 产物，这样的基因统称为目的基因。具有优良性状的 基因理所当然是目的基因，而致病基因在特定情况下 同样可作为目的基因，具有很大的开发价值。 即使是那些今天尚不清楚功能的基因，随着研究的深 入，也许以后成为具有很大开发价值的目的基因。 22 （3）生物基因组学研究（3）生物基因组学研究 近年来越来越重视基因组的研究工作，试图搞清楚某种生物基因 组的全部基因，为全面开发各种基因奠定基础。 据统计，至1998年完成基因组测序的生物有11种。 早在20世纪80 年代就有人对人类基因组产生兴趣，提出人类基因组研究计划。 从1990年开始，先后由美国、英国、日本、德国、法国等国实施 “人类基因组计划”，我国于1999年9月也获准参加这一国际性计 划，承担人类基因组1的测序任务。一旦人类基因组全部被破 译，就可了解人类几千种遗传性疾病的病因，为基因治疗提供可 靠的依据，并且将保证人类的优生优育，提高人类的生活质量。 我国已启动了“水稻基因组计划”，并于2001年10月12日宣布中国水 稻基因组“工作框架图”和数据库在我国已经完成。 23 二、基因工程应用研究二、基因工程应用研究 基因工程应用研究涉及医、农、牧、渔等产业，甚 至与环境保护也有密切的关系。 包括基因工程药物研究，基因疫苗研究，转基因植 物研究，转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品 工业、化学与能源工业及环境保护等方面。 其中研究成果最显著的是基因工程药物和转基因 植物的研究，已取得了可喜的成果。 24 三、基因工程受体系统的研究三、基因工程受体系统的研究 基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前 者是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场 所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、 甚至是个体。用作基因工程的受体可分为两类，即 原核生物和真核生物。 25 四、基因克隆的通用策略四、基因克隆的通用策略 Chromosome D