,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,：能编码蛋白质,编码区,非编码区,：由编码区上游和编码区下游的DNA序列组成，不能编码蛋白质。,有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,：能编码蛋白质,编码区,非编码区,：由编码区上游和编码区下游的DNA序列组成，不能编码蛋白质。,有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA短片段，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶:由多个肽链构成的蛋白质。能够识别调控序列中的结合位点并与其结合，催化DNA转录为RNA。,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,知识点一：2.真核细胞的基因结构,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,什么是目的基因？,主要是编码蛋白质的基因； 也可以是一些具有调控作用的因子。,获取目的基因的常用方法有哪些?,从基因文库中获取目的基因,利用PCR技术扩增目的基因,用化学方法人工合成目的基因,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？,2.基因文库的分类:,只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。,含有一种生物的全部基因,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？,2.基因文库的分类:,3.怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？,据目的基因的有关信息，获取目的基因。,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？,2.基因文库的分类:,3.怎样从基因文库中得到我们所需要的基因呢？,4.怎样构建基因文库？,求异思维,你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？,但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。,一、目的基因的获取,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR：,（1）概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,（2）PCR技术是由_等人于_年发明的， 为此1993年获得_奖,穆里斯,1988,诺贝尔化学,（3）原理：,DNA双链复制,PCR的原理（DNA体内复制相关知识）,条件：,引物：,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3端延伸DNA链。因此复制需引物,一、目的基因的获取,（二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR：,（1）概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,（2）PCR技术是由_等人于_年发明的， 为此1993年获得_奖,穆里斯,1988,诺贝尔化学,（3）原理：,DNA复制,（4）前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。,条件：,引物：,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上(从3端延伸DNA链)。因此复制需引物,模板DNA：,dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP,热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,PCR技术扩增过程：,：当温度上升到9095以上时，双链DNA解聚为单链,每个循环包括：,：温度下降到5560 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。,：温度上升到7075 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，根据碱基互补配对原则从引物起进行互补链的合成。,变性9095oC,PCR技术扩增过程：,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,每次循环（复制）后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n）。,时间（min）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复13步30轮,2、具体过程,PCR技术扩增与DNA复制的比较,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,主要在细胞核内,热稳定DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,一、目的基因的获取,（二）利用PCR技术扩增目的基因,（一）从基因文库中获取目的基因,（三）化学方法直接人工合成目的基因,（基因比较小,核酸序列已知),二、基因表达载体的构建,1、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,基因工程的核心,2、基因表达载体的组成：,它们各自的作用是什么?,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,三、将目的基因导入受体细胞,1.转化：,3.转化方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,2.受体细胞,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,植物体受损伤处细胞会分泌酚类化合物吸引农杆菌，农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：,原理：,-采用最多的方法,过程：,优点：,经济和有效,（2）基因枪法,（3）花粉管通道法,常用于单子叶植物，成本较高,简便经济,2、将目的基因导入动物细胞,-采用最多、最为有效的方法,显微注射法,方法：,受体细胞：,程序：,3、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：,大肠杆菌细胞最常用的转化方法：,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,-目的基因能否在真核细胞中稳定遗传的关键,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,（一）、检测,提取出转基因生物基因组DNA,用放射性同位素等标记含目的基因的DNA片段作为探针,探针和转基因生物的基因组DNA杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,-目的基因能否在真核细胞中稳定遗传的关键,方法:,DNA分子杂交,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,-检测目的基因是否发挥功能的第一步,方法:,分子杂交（注意与上不同之处）,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交,（二）、鉴定（个体生物学水平）,（一）、检测,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,归纳步骤,抗虫棉的接种实验,基因工程操作流程图,小 结：,寻根问底,将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载 体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物，此法目前争议颇多，严格讲不算基因工程。,思考与探究,1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能 分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？ 若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论 上说，你应该如何做？,原因：主要酚类诱导物，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。,如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导性）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3、利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞 器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下 ，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔 基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中 ，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖 蛋白是不可能的。,4、-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分 异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如 让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白， 想一想，应如何进行设计？,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。,（2）将cDNA前序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加 上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。,（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环 素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌。如果表达载体未进入大肠 杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养 基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。,（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后 从中提取-珠蛋白。,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基