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点评,1.菌落-不称为点点或颗粒物。 2. 结果描述条理应该清晰,而不是简单的堆砌。 3. 设计题完成情况不理想。 4.显微镜使用, 复位,清洁、签字(尼康)。,实验5 革兰氏染色法 荚膜染色,一、实验目的,目的: 1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术; 2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法; 3.掌握染色原理。,二、原理,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G )两大类,是细菌学上是常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G菌细胞壁中肽聚糖层厚(20-80nm,15-50层)且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层)、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经番红复染后就成红色。,金黄色葡萄球菌革兰氏染色图,大肠杆菌革兰氏染色图,革兰氏染色的实际意义,(1)鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定. (2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感度不一.例如大多数阳性菌对青霉素敏感,大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考. (3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素。,荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质,含水量大,其他成分多为多糖、多肽或糖蛋白。 细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱,不易着色,且易被水洗去,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上,固染色时一般不加热固定,以免荚膜皱缩变形。,荚膜功能: 抗吞噬作用:荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用,可有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。 粘附作用:荚膜多糖可使细菌彼此间粘链,也可粘附于组织细胞或无生命物体表面,是引起感染的重要因素。 抗有害物质的损伤作用:处于细菌细胞最外层,荚膜犹如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤,如溶菌酶、补体等。 抗干燥作用:荚膜多糖为高度水合分子,含水量在95%以上,可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。 荚膜用途: 用于菌种鉴定、用作药物和生化试剂、用作工业原料等。有荚膜的菌形成的菌胶团对污水中的污染物有极强的吸附、降解的作用。,形成条件: 荚膜的形成与环境条件密切相关。一般在动物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成荚膜,在普通培养基上或连续传代则易消失。 产荚膜的细菌形成的菌落一般具有直径较大,无色透明,隆起明显,用接种环挑取时可拉出粘丝等特点。,三、实验材料,革兰氏染色: (1) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)斜面;或选用自己保种的细菌。 (2) 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95乙醇、石炭酸复红液等)、 (3) 香柏油、二甲苯;显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,四、实验步骤,菌体适中,玻璃涂成薄膜,不宜太厚,用后接种环用火焰灭菌。,制作涂片,四、实验步骤,晾干,易于染色,3-6次过火固定,强度适中,不宜烫手,初染,1-2min,所有染色过程染液不可干涸,水洗至水流无色,媒染,先冲去残留水,媒染1min,水洗并沥干,脱色,脱色至流出液为无色,一般20-30s-1min,水洗并沥干。整个过程不要靠近火焰。,复染,1-2min,所有染色过程染液不可干涸,water,水洗,晾干,镜检。,注意事项,1、染料避免干涸,酒精脱色务必避开火焰。 2、老龄菌易被染成红色(细胞通透性出现变化),造成假阴性。一般选用生长活跃的菌体进行染色。(18h-32h) 3、涂片过厚或菌悬液过浓,导致细胞大量堆积,容易导致脱色不完全,造成假阳性。染色结果以分散良好的细菌染色结果为准。 4、酒精脱色不够导致假阳性,脱色过渡导致假阴性。 5、控制好染色区域,保证整个染色过程及最后镜检在同一个区域进行,可用铅笔标记 。,思考题,可用什么方法证明革兰氏染色是成功的? 革兰氏染色中,哪一个步骤可以省去而不影响最终结果?在什么情况下可以采用? 革兰氏染色哪一步最关键?,五、实验内容及结果,大肠杆菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色,绘图,并记录染色结果(颜色,G+或G-)及放大倍数(包括物镜及目镜)等等。,大肠杆菌光学显微镜图(革兰氏染色) 放大倍数:1000 ,解析:大肠杆菌,杆状,菌体为粉红色,属革兰氏阴性菌,1. 细菌的革兰氏染色,金黄葡萄球菌光学显微镜图(革兰氏染色) 放大倍数:1000 ,荚膜染色,实验材料: (l) 同学们自己培养的细菌, 或菌株vv6/vv52/XH7 (2) 1%甲基紫或结晶紫染色液、黑色液(墨汁)。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。,实验步骤,1制片:在干净载玻片一端滴一小滴无菌水,取少许细菌在水滴中制成悬液。取一小滴墨汁(或一接种环墨汁)与菌悬液混合,另取一块载玻片作为推片,将推片一端平整的边缘与菌悬液以30度角接触后,顺势将菌悬液推向前方,使其成匀薄的一层,风干。 2固定:用纯甲醇固定1分钟,立即倾去甲醇,自然晾干。 3染色:加结晶紫/番红/碱性复红/甲基紫染液数滴于涂片上,染1-2min,以细水流适当冲洗,吸去水后自然晾干。 4. 油镜观察结果。 先用低倍镜再高倍镜观察。 结果:背景黑色,菌体紫色或红色,荚膜呈一清晰透明圈。,图6-2荚膜染色制片法,注意事项,1、玻片干净无油脂。 2、墨水使用量适中,关键是涂片要薄。 3、整个过程不加热,固定使用甲醇,甲醇有较强的毒性且易挥发,对人体的神经系统和血液系统影响最大 ,请同学使用过程特别留意。,实验内容及结果,2株菌株荚膜染色,绘图,记录染色结果(菌体及荚膜形态)及放大倍数(包括物镜及目镜)。,菌株SJJM光学显微镜图(荚膜染色) 放大倍数:1000倍,2. 细菌的荚膜染色,解析:,菌株vv6光学显微镜图(荚膜染色) 放大倍数:1000倍,思考题,1、荚膜染色,为什么不能热固定? 2、荚膜负染法,荚膜为何不着色而菌体着色?,
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