张雪梅 检验医学院,蛋白质与酶工程 酶学基本理论,一、了解酶的分类与命名 二、酶的分子结构 1、掌握酶的概念、组成及分类，辅酶、辅基的概念。 2、掌握酶的活性中心的概念，了解同工酶、抗体酶的概念。 三、酶的工作原理 1、掌握酶的高度催化效率的本质与诱导契合学说。 四、酶促反应动力学 1、掌握酶促反应中，各因素对酶促反应的影响，最适温度、最适pH的概念。 2、掌握米曼氏方程，米氏常数Km、Vmax的意义及其双倒数作图法测定和Hanes作图法。 3、掌握可逆抑制、不可逆抑制、竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制的概念及动力学特点。 五、酶的调节方式 1、掌握酶活性的调节方式 2、掌握酶量调节的方式,酶的概念,目前将生物催化剂分为两类 酶 、 核酶（ribozyme）,酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸。,第 一 节 酶的分类和命名,酶的分类与命名原则（自学为主）,P酶和R酶数量高达数千种 要准确地识别各种酶，避免发生混乱或误解，就必须建立一套酶的 分类(classification)和 命名(nomenclature) 的原则,国际系统分类命名法原则- （1）根据酶的底物来命名 Ribonuclease 核糖核酸酶 Protease 蛋白酶 （2）根据所催化的反应类型来命名 Dehydrogenase 脱氢酶 Phosphotransferase 磷酸转移酶 Aminotransferase 转氨酶 （3）上述两个原则结合- 丙酮酸脱氢酶 （4）上述原则再加上酶的来源 如：牛胰核糖核酸酶,1、P酶的分类与命名,国际酶学委员会（international commission of enzyme, ICE)于1961年提出了酶的分类与命名方案，此后不断得到补充和修改 其建议：每一种酶都有其推荐名和系统命名 推荐名：由两部分组成-底物名称+催化反应类型+“酶” 如：葡萄糖氧化酶 *对于水解酶类，可省去“水解”, 如：淀粉酶，蛋白酶，乙酰胆碱酶等 *必要时再加上酶的来源或其它特性， 如：菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶等,P酶的分类原则 1）按照其催化作用的类型，分为6大类 2）每大类中，按底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类 3）每一亚类中分为若干小类 4）每一小类包含若干个具体的酶,国际系统分类法及酶的编号、反应通式,1、氧化还原酶（1） AH2BABH2 2、转移酶 （2） ABCABC 3、水解酶 （3） ABH2OAOHBH 4、裂合酶（4） ABAB 5、异构酶 （5） AB 6、连接酶或合成酶（6） ABATPABADPPi 或 ABATPABAMPPPi 六大类编号依次为 1. 2. 3. 4. 5. 6 亚类编号依次为 1. 2. 3. 4. 5. 6. 亚亚类编号依次为 1. 2. 3. 4. 5. 6.,（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases）： 包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等 其催化的反应通式：AH2 + B = A + BH2 被氧化的底物(AH2）为氢或电子供体 被还原的底物（B）为氢或电子受体 系统命名：供体在前，受体在后，再加上氧化还原 酶字样，即 “醇：NAD + 氧化还原酶” 其推荐名：某供体脱氢酶（谷氨酸脱氢酶） 或某受体还原酶（硝酸还原酶）,（2）转移酶类（Transferases）： 包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等 催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的一类酶。反应通式： AB + C = A + BC 系统命名-供体：受体+某基团转移酶 如：L-天冬氨酸：2-酮戊二酸氨基转移酶 推荐名- 受体（或供体）+某基团转移酶 上述同一酶为： L-天冬氨酸氨基转移酶,（3）水解酶类（Hydrolases）： 包括蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、肽酶等；一般不需要辅酶，催化各种化合物进行水解反应的一类酶，其反应通式为：AB + H2O =AOH + BH 系统命名：底物+发生水解作用的化学键位置+水解酶 如：5-核苷酸磷酸水解酶，其底物是5-核苷酸，水解反应发生在磷酸酯键上 推荐名：底物+酶，如5-核苷酸酶,（4）裂合酶类（Lyases）： 催化一个化合物裂解为2个较小的化合物及其逆反应的一类酶，其反应通式：AB=A+B 一般裂合酶在裂解反应方向只有一个底物，而在缩合反应方向却有2个底物 系统命名：底物+裂解的基团-裂合酶,如：草酸：羧基-裂合酶，表明其催化草酸在羧基位置发生裂解反应 推荐名：底物+脱羧酶或醛缩酶或脱水酶等，而在缩合反应方向则加“合酶”（synthase) 如草酸脱羧酶（草酸=甲酸+CO2)苏氨酸醛缩酶（L-苏氨酸=甘氨酸+乙醛），乙酰乳酸合酶（2-乙酰乳酸+CO2=2-丙酮酸）等,（5）异构酶（Isomerase）： 催化分子内部基团位置或构象转换的一类酶，其反应通式： A=B，按异构化的类型不同，分为多个亚类： 底物+异构酶 或底物+消旋酶 或底物+变位酶 或底物+表异构酶 或底物+顺反异构酶等 如：葡萄糖异构酶催化“D-葡萄糖=D-果糖” 丙氨酸消旋酶催化“L-丙氨酸=D-丙氨酸”,（6）连接酶或合成酶（Ligase or synthetase): 其关系到很多生命物质的合成，其特点是需要ATP等作为能源，有的还需要金属离子作辅助因子，分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键(与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键，是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解，催化2个分子进行连接反应的酶，其反应通式： A+B+ATP=AB + ADP +Pi 或AB+AMP+PPi 系统名：2个底物的名称+连接酶， 推荐名：合成产物+合成酶。 如：天冬氨酸：氨连接酶，其推荐名是天冬氨酰合成酶（L-天冬氨酸+氨+ATP=L-天冬酰胺+ADP+Pi）,2）R酶的分类和命名,通常按照其催化的作用底物、反应类型和酶本身的机构特点进行分类 （1）根据其底物是本身RNA还是其它分子，分为 分子内催化（自我催化）或分子间催化 (2）根据其催化反应的类型分为：剪切酶（只剪）、剪接酶（剪+连接）和多功能酶 （3）根据其结构特点，分为：锤头型、发夹型、含I型间插序列（IVS）和含II型IVS的R酶,分子内催化的R酶,（1）自我剪切酶：即在一定条件下催化自身RNA分子进行剪切反应； 都是RNA的前体，自我催化后，将前体剪切为成熟的RNA分子和另外一个RNA片段 如：T4噬菌体RNA前体（215nt）催化自身成为成熟RNA (139nt）和一个76nt的片段 （2）自我剪接酶：在一定条件下催化自身RNA分子同时进行剪切和连接反应；都是RNA前体,分子间催化的R酶,据其所作用的底物分子不同，分为若干亚类- （1）RNA剪切酶 （2）DNA剪切酶 （3）多肽剪切酶 （4）多糖剪切酶 （5）多功能R酶：催化其它分子进行多种反应的R酶，例如 L-19 IVS能够催化RNA剪接、限制性内切、去磷酸等作用,氧化还原酶类 Oxidoreductases 转移酶类 Transferases 水解酶类 Hydrolases 裂合酶类 Lyases 异构酶类 Isomerases 合成酶类 Synthetases Synthases,分子内催化R酶(in cis ribozyme) 自我剪切酶(self-cleavage rebozyme) 自我剪接酶(self-splicing rebozyme),分子间催化R酶(in trans ribozyme) RNA剪切酶 DNA剪切酶 多肽剪切酶 多糖剪接酶 多功能R酶 其它R酶,蛋白类酶 proteozyme,核酸类酶 ribozyme,酶 enzyme,酶的分类总结,第二节 酶的分子结构与功能 The Molecular Structure and Function of Enzyme,酶的不同形式,单体酶(monomeric enzyme)：仅具有三级结构的酶。 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。 多酶体系(multienzyme system)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶(tandem enzyme)：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。,一、 酶的分子组成,单纯酶 (simple enzyme) 结合酶 (conjugated enzyme),金属酶(metalloenzyme) 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失（如羧基肽酶Zn、黄嘌呤氧化酶Mo等）。 金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密（如己糖激酶Mg）。,金属离子,小分子有机化合物在催化中的作用,辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度）,辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。,辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去(FAD、FMN)。,二、酶的活性中心,必需基团(essential group) 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。,目 录,或称活性部位(active site)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。,酶的活性中心(active center),活性中心内的必需基团,位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。,活性中心外的必需基团,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,目 录,溶菌酶的活性中心,* 谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团；,* 色氨酸62和63、天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团；,* AF为底物多糖链的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。,63,活性中心 结合部位 必需基团 催化部位 酶的结构 活性中心以外的必需基团 其它部分,三、同工酶和抗体酶,1、同工酶(isoenzyme) 是指催化相同的化学反应但一级结构不同的一组酶，其理化性质、免疫学性质等也不相同。,举例：乳酸脱氢酶 (LDH1 LDH5 ),电泳速度， Km值不同,15速率逐渐变快,*生理及临床意义 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。,近期发现，雄性动物精子中还有另一种同工酶LDH-X，反应精子活力,2、抗体酶（abzyme）或催化抗体（catalytic antibody) 定义：是具有催化功能的抗体 本质：免疫球蛋白，其易变区被赋予了酶的属性，即具有催化作用的免疫球蛋白 优势：为人们提供了一条合理途径去设计需要的酶，尤其是目前难以获得的甚至是还没有的酶。,将抗体转变为酶主要方法： 诱导法：利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗 Pollack等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱导产生单抗，经筛选找到加快其水解反应1.2万倍的抗体酶 引入法：借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能 拷贝法：主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计,抗体酶的应用,一种抗体酶可切开血纤维蛋白（血凝块的主要成分），可以用于溶栓治疗 一些抗体酶可固定在癌细胞突出的蛋白质上，破坏癌细胞膜，将用于癌症治疗 一些抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合 立体专一性抗体酶的研究，使生产