2011 Waters Corporation 2 内容内容内容内容 ? 介绍 进行方法开发的途径 系统性方法开发 ? 影响选择性的主要因素 固定相 有机溶剂 流动相pH值 流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法 ? 系统性方法开发策略 雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例 ? 沃特世HPLC色谱柱产品 2011 Waters Corporation 3 内容内容内容内容 ? 介绍 进行方法开发的途径 系统性方法开发 ? 影响选择性的主要因素 固定相 有机溶剂 流动相pH值 流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法 ? 系统性方法开发策略 雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例 ? 沃特世HPLC色谱柱产品 2011 Waters Corporation 4 方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性方法开发的挑战性 ? 质量研究方法开发工作贯穿于整个药物开发项目过程中 样品的复杂程度各异 工作繁复冗余 ? 方法开发耗时耗力、成本不菲 加速流程才能尽早将产品带入市场 提速色谱方法将提高项目收益率 2011 Waters Corporation 5 方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤方法开发过程中的关键步骤 2011 Waters Corporation 6 ? 根据分析物的化学性质选配色谱条件 基于既往经验及思考进行合理猜测 通常辅以资料参考 询问同事 ? “步进式”测试开发 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行 ? 系统性筛选策略 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 o 评估结果，选择最有效的条件组合 再进行方法优化 o 梯度/温度 色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路色谱条件的开发思路 2011 Waters Corporation 7 色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱 流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相溶剂流动相流动相流动相流动相pH Selectivity 液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段液相色谱分离选择性的产生手段 分离选择性分离选择性分离选择性分离选择性 2011 Waters Corporation 8 内容内容内容内容 ? 介绍 进行方法开发的途径 系统性方法开发 ? 影响选择性的主要因素 固定相 有机溶剂 流动相pH值 流动相pH值应用实例：林可霉素杂质分析方法 ? 系统性方法开发策略 雷尼替汀强迫降解产物分析HPLC方法开发实例 ? 沃特世HPLC色谱柱产品 2011 Waters Corporation 9 影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素影响分离度的因素 选择性最为重要选择性最为重要选择性最为重要选择性最为重要 1 1 + k k 4 N =Rs Maximized in UPLC Separations by: ?Range of column chemistries ?Multiple particle substrates ?Wide usable pH range BEH ?High retentivity HSS ?Wide range in selectivity CSH Maximized in UPLC Separations by: ?Ultra-low dispersion system ?Small 400% 2011 Waters Corporation 10 2011 Waters Corporation 11 直观图表显示直观图表显示直观图表显示直观图表显示pH 7 pH 7 pH 7 pH 7 选择性选择性选择性选择性（RPRPRPRP） (ln k acenaphthene) YMC-Pack ODS-A YMC Jsphere ODSH80 ACQUITY UPLCBEH XBridge C18 Hydrophobicity 062010 SunFire C18 YMC-Pack PolymerC18 Hypersil CPS Cyano YMC-Pack CN Waters Spherisorb S5 P ACQUITY CSH XSelect CSH Fluoro-Phenyl Nova-Pak Phenyl YMC-Pack Phenyl Hypersil Phenyl Inertsil Ph-3 YMC-Pack Pro C4 YMCbasic Symmetry C8 YMC-Pack Pro C8 Nova-Pak C8 XTerraMS C18 Symmetry C18 YMC-Pack Pro C18 Inertsil ODS-3 Nova-Pak C18 YMC Jsphere ODSL80Nucleosil C18 Waters Spherisorb ODS2 Waters Spherisorb ODS1 Resolve C18 Bondapak C18 YMC-Pack ODSAQ YMC Jsphere ODSM80 Inertsil CN-3 Waters Spherisorb S5CN Nova-Pak CN HP SymmetryShield RP8 SymmetryShield RP18 XTerra RP8 XTerra RP18 -0.6 -0.3 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7 3 3.3 3.6 -1.5-0.50.51.52.53.5 (ln amitriptyline/acenaphthene) XTerraMS C8 Luna C18 (2) XTerra PhenylLuna Phenyl Hexyl ChromolithTM RP-18 AtlantisdC18 Zorbax XDB C18 ACT Ace C18 Zorbax SB C18 SunFire C8 Luna C8 (2) ACQUITY UPLCBEH XBridge Shield RP18 ACQUITY UPLCBEH XBridge C8 ACQUITY UPLCBEH XBridge Phenyl Atlantis T3 ACQUITY UPLCHSS T3 HSS HPLC T3 ACQUITY UPLCHSS C18 HSS HPLC C18 ACQUITY UPLCHSS C18 SB HSS HPLC C18 SB 沃特世提供10种不同反相UPLC/HPLC柱固 定相，覆盖广泛范围下的选择性和疏水性 Selectivity ACQUITY CSH XSelect CSH C18 ACQUITY CSH XSelect CSH Phenyl-Hexyl Hypersil BDS Phenyl Silanol Activity 2011 Waters Corporation 12 沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具沃特世色谱柱选择性图表工具 2011 Waters Corporation 13 考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型考察模型 ? 利用一组性质不同的参考化合物在不同色谱柱上进行实验, 以找出不同实验 因素(色谱柱、溶剂和pH)对分离选择性影响的一般规律 4.6 x 100 mm, 3.5 m 色谱柱 Ammonium Formate (甲酸铵缓冲液), pH 3 Ammonium Bicarbonate (碳酸氢铵缓冲液), pH 10 Methanol Acetronitrile 使用10 至 90% 溶剂的15分钟梯度 柱流速 1.4 mL/min 仪器为Waters Alliance2695 HPLC连接2996 PDA和MicromassQuattro micro 2011 Waters Corporation 14 12. Octanophenone (N) MW 204.3 5. 1-Pyrenesulfonic acid (A) MW 304.3 参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构: : I.I.有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质有机酸与中性物质 10. Diclofenac (WA) MW 318.1 NH O-O Cl Cl Na+ 11. Dinoseb (A) MW 240.2 N+ N+ O- O- O O OHCH3 CH3 1. Gentisic Acid (A) MW 154.1 OOH OH OH 8. Flavone (N) MW 222.2 O O 2011 Waters Corporation 15 N CH3 CH3 NH OH OHOH CH3 3. Ritodrine (B) MW 287.4 N N CH3 O CH3 OH H 4. Hydroquinidine (B) MW 204.3 7. Amitriptyline (B) MW 277.46. Imipramine (B) MW 280.4 2. Caffeine (WB) MW 194.2 N N N N O O CH3 CH3 CH3 N N CH3 CH3 O N 9. 4-Dimethylamino- benzophenone (WB) MW 225.3 参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构参考化合物的结构: II.碱性物质碱性物质碱性物质碱性物质 2011 Waters Corporation 16 SunFire C8 SunFire C18 2 1 3 5 4 76 9 8 11 10 12 2, 1 3 54 76 9, 10 8 11 12 分离选择性差异分离选择性差异分离选择性差异分离选择性差异 SunFire C8与与与与 SunFire C18 相同基质颗粒上的C8和C18间分离选择性的差异微小. C8 对某些化合物的保留比C18小些. 1.Gentisic Acid (A) 2.Caffeine (WB) 3.Ritodrine (B) 4.Hydroquinidine (B) 5.1-Pyrenesulfonic acid (A) 6.Imipramine (B) 7.Amitriptyline (B) 8.Flavone (N) 9.4-Dimethylaminobenzophenone (WB) 10.Diclofenac (WA) 11.Dinoseb (A) 12.Octanophenone (N) 低低低低 pH, 乙腈乙腈乙腈乙腈 2011 Waters Corporation 17 相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分离选择性差异相同基体不同键合相的分