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浓缩胶和分离胶的PH值不同,前者主要表现为浓缩效用,后者表现为电荷效用和分子筛效用。浓缩效应主要在浓缩胶中完成,浓缩胶的pH6.8,在这个pH条件下,缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离,Gly的等电点为6.0,仅少数解离为负离子,在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH下解离为负离子,三类离子的迁移速率为Cl一般蛋白质Gly,电泳开始后,Cl离子泳动快,在其后留下一个低离子浓度区。Gly在电场中移动很慢,造成移动离子的缺乏,于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区,在高压区内所有的负离子都会加速移动,当移到Cl离子区域时,高电压消失,蛋白质的移动速度慢下来,当以上稳定状态建立后,蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层,并按蛋白质所带负电荷量的多少依次排列成带,浓缩样品,从浓缩胶进入分离胶后,胶的pH升高,Gly的离解度增大,泳动率上升,又因为它分子小,故超过所有的蛋白质分子,紧跟在Cl离子后,Cl离子迁移后,低离子浓度不再存在,形成了恒定的电场强度,因此,蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质,分子大小和形状,分离胶的孔径有一定大小,对不同相对质量的蛋白质来说,通过时收到的滞阻作用不同,即使静电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开。10和12胶的差别:根据你目的蛋白分子量而定,如果说是分子量较大的蛋白(60KD以上),可以用10的胶,分子量在6030KD之间的可以用12的胶,低于30KD的我一般都是用15的胶了。主要在于指示线刚好跑出胶底的时候,你的目的蛋白能够恰好处于胶的中间部分。凝胶的浓度大小不同所对应的凝胶孔径大小也不同,浓度小的孔径大,浓度大的孔径小,一般分离胶用12%的,浓缩胶用5%的,因为浓缩胶的目的就是将所有的蛋白浓缩在同一起跑线上,然后一块进入分离胶分离。 据蛋白大小定。Western Blot转膜在电流的作用下,使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上。膜的选择:印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附、物理强度,以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格:Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间,通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流,起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上,所以其转移条件比较严酷,但是其转移时间短,效率高。1 实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2,我们通常100mA/膜,按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间80-140 8% 1.5-2.025-80 10% 1.51540 12% 0.75=膜=胶。2)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路。3)因为膜的疏水性,膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中,膜也必须随时保持湿润(干膜法除外)。4)滤纸可以重复利用,上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质,所以上下滤纸一定不能弄混,在不能分辨的情况下,可以将靠胶滤纸换新的。5)转移时间一般为1.5 小时,( 1mA-2mA/cm2,10% gel),可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。1)在叠膜、胶、纸三明治时候,操作于盛有转膜Buffer的大平皿中进行,叠好后,再将三者平行转移至转膜装置,切勿再移动,因为在buffer中操作,已经完全排除了气泡存在的可能,无需再赶气泡2)关于转膜时间:半干转的话,20 V30min即可B 湿法我们基本上不用此方法,这里暂不做介绍。C 转移后效果的鉴定1染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后,看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2染膜有两类染液选择,可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等,这类染料染色后,色素可以被洗掉,膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料,如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等,染色后膜就不能用于进一步的分析。
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