病毒载体携带自杀基因D m d N K ( 果蝇脱氧核糖核苷 酸激酶) 对实体肿瘤双重分子靶向治疗的研究 D o u b l et a r g e t i n gA n t i t u m o rE f f e c t so fv i r u sV e c t o r s I n d u c i n gM u l t i s u b s t r a t eD e o x y r i b o n u c l e o s i d eK i n a s eo f D r o s o p h i l aM e l a n o g a s t e r ( D m - d N K ) 导 论文课题起止时间：2QQ 2 生三旦= 2Q ! ! 生羔2 旦 论文完成时间：2Q 12 生圣旦 中国医科大学( 辽宁) 20 12 年3 月 中国医科大学研究生学位论文独创性声明Y 2 胛0 聊9 删2 舢0 删删4 8 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 勤卜啡 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 结论2 4 论文二 前。言2 5 刖舌二J 材料与方法2 6 结果( 附论文图片) 3 5 i 寸论4 2 结论4 3 论文三 前言4 4 刖看忡 材料与方法4 6 结果( 附论文图片) 5 4 t 寸论6 3 结论6 4 四、本研究创新性的自我评价6 5 五、参考文献6 6 王 、 中文论著摘要 病毒载体携带自杀基因D m d N K ( 果蝇脱氧核糖核苷 酸激酶) 的抗肿瘤研究 目的 自杀基因辅以前药治疗( g e n ed i r e c t e de n z y m ep r o d r u gt h e r a p y ，G D E P T ) 在近 2 0 年的研究中取得较大成绩。广泛应用的基因治疗系统为单纯疱疹病毒1 型胸腺嘧 啶激酶戊环鸟苷( H S V - T K G C V ) 系统。H S V - T K 有着很高的催化效率，但 H S V - T K G C V 得杀伤机制还未完全明确，而且H S V - T K G C V 系统用于自杀基因辅 以前药治疗的主要缺点在于当其杀伤靶细胞后，有毒性的三磷酸化物G C V - T P 会杀 伤临近细胞。自杀基因辅以前药治疗综合了分子治疗，酶激活前药治疗，基因前 药治疗，是基因治疗的巨大进步，同时需要增强对前药毒性的进一步控制。虽然 在基础实验的治疗效果被肯定，但自杀基因在临床上的应用有着杀伤效率有限及 使用安全性问题。 果蝇多底物脱氧核苷酸激酶基因( m u l t i s u b s t r a t ed e o x y r i b o n u c l e o s i d ek i n a s eo f D r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ，D m - d N K ) 能够催化自然界所有嘌呤嘧啶脱氧核糖核酸 的磷酸化反应，除了其广泛的底物特异性，这种激酶还表现出惊人的催化效率要 高出我们所曾了解的核酸激酶效率的1 0 1 0 0 倍。在最近的实验中，研究者试着使 D m - d N K 在癌细胞种系中表达来起到一种自杀基因的作用，试验成功证明这种酶 在癌细胞表达的可能性以及其在癌细胞中酶活性的保持，不仅如此D m d N K 还增 加了癌细胞对某些化疗药物的敏感性。 选择复制性腺病毒( C o n d i t i o n a l l yr e p l i c a t i n ga d e n o v i r u s e s ，C R A d s ) ，也称为 溶瘤腺病毒，它为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的平台。选择复制性腺病毒不但 只感染肿瘤细胞并杀死它们，而且对正常细胞没有杀伤效果。对实体肿瘤同样效 果明显。选择复制性腺病毒克服了传统基因治疗的缺点，包括感染率低，没有特 异性，杀伤效果差等。在放疗，化疗等传统治疗无能为力时，C R A d s 更好的诠释 了其自身的特点。然而，C R A d s 的复制有时难以控制，从而导致它在正常细胞中 的复制并发生了副反应。这就急需提高它的安全性及可控性。 我们构建了新的病毒载体携带D m D N K ，进一步我们在体外，体内试验中检 测D m - D N K 的抗肿瘤特性。 方法 一、细胞培养 肿瘤细胞系购买于上海细胞库，正常细胞购买于A T C C 细胞使用L 1 5 培养基 或高糖D M E M 培养。培养基中含有1 0 的血清，双抗。培养环境为3 7 ，5 C 0 2 二、W e s t e r nb l o t 检测蛋白表达 细胞均匀铺于6 孔板( S x l 0 5c e l l s w e l l ) ，2 4 小时后，给予病毒及前药处理。 4 8 小时后，提取蛋白液。 取l m l l 0 分离胶溶液，加5 u l T E M E D 后混匀，加入玻璃板内底部聚合封口； 将槽内多余液体倒去，水洗3 次，剩余9 m 1 分离胶溶液加5 u l T E M E D 混匀，注入 玻璃板内，加水覆盖；聚合完成后倒掉水覆盖物，以1 0 的积层胶4 m l ，加入 5 u l T E M E D 混匀，注入分离胶上端：插入加样梳，将凝胶玻璃板放入电泳槽，聚 合5 6 分钟，缓慢拔去加样梳，水洗加样孔；将样品和S D S 加样缓冲液等比混合， 1 0 0 。C 加热3 分钟使蛋白变性，按顺序加样；5 0 V 电泳，至染料抵达分离胶与积层 胶交界处；1 0 0 V 电泳，至染料抵达分离胶底部；将硝酸纤维薄膜漂浮于转移缓冲 液，借毛细作用湿润，做好标记；将3 M M 滤纸浸泡于转移缓冲液，取下凝胶置 于硝酸纤维薄膜上，再置于6 张3 M M 滤纸中间，4 0 0 m A ，电转移3 0 分钟至硝酸 纤维薄膜上：丽春红S 染液染色2 分钟，观察转膜情况，去离子水清洗，I x T B S T 平衡3 次，每次5 分钟；封闭液封闭l 小时，l x T B S T 洗膜3 次，每次5 分钟；加 I 抗反应，室温l 小时，l x T B S T 洗膜3 次，每次5 分钟；加2 抗，室温反应l 小 时，I x T B S T 洗膜三次，每次5 分钟；加入显色液，每张膜上均匀铺8 0 0 u l ，作H R P 发光反应反应2 分钟。将膜倒置，贴于保鲜膜上，折叠，封好，贴于增感屏。在 暗室中压片，曝光于X - 光片( K o d a k 公司) ，分别曝光3 0 s 5 m i n 。 三、酶活性检测 2 蛋白提取液用放射性 3 H 】标记作为底物的核苷酸药物，混合液在W h a t m a n D E 8 1 滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。 四、C P E 实验检测细胞杀伤 取对数生长期的肿瘤细胞及正常细胞，接种于2 4 孔培养板中，2 4 h 细胞贴壁 后，吸去上清，按M O I = 0 ，0 1 ，1 ，1 0 ，1 0 0 加入病毒，设实验组及对照组。3 7 ， 5 C 0 2 孵箱培养4 h 后洗去病毒液，每孔加l m l 培养液继续培养。4 8 h 后于倒置显 微镜下观察、拍照。 五、流式细胞术检测细胞凋亡 ( 1 ) 对数生长期的细胞计数铺板，按合适密度铺板，分别感染病毒，同时设 立阴性对照，3 7 ，5 C 0 2 孵箱培养4 h 后洗去病毒液，每组加入培养液继续培 养。感染后2 4 h 加入前药或P B S 感染后4 8 h 结束实验。 ( 2 ) A n n e x i n - V - F I T C 染色 根据A n n e x i n v - F I T C P I 试剂使用说明调整细胞为1 0 6 个m l ，离心弃上清，加 入1 0 1 t l A n n e x i nV o F I T C 和5 1 dP I ，轻摇匀，室温避光反应1 5 m i n ，l h 内流式细胞 仪检测，各组细胞用流式细胞计量仪分别进行检测。 六、细胞杀伤实验 细胞按照一定密度铺于9 6 孔板，培养2 4 小时后，给予病毒及前药处理，4 8 小时后，加入M T T ( 5 m g m 1 ) 2 0 1 x l 孔，孵育4 h 后小心吸弃孔内上清液，加入 D M S O l 0 0 p I 孔，振荡l O m i n ，酶标仪测定光密度值( O D 5 7 0 ) ，取3 孔平均值记 录结果。R 4 5 0 型酶标仪测5 7 0 n m 处光吸收值( O D 5 7 0 n m ) 。以不感染病毒细胞的 O D 5 7 0 n m 为标准，其他孔的O D 5 7 0 n m 与其相比即为该孔的细胞存活百分数，而 细胞杀伤率( ) = 1 细胞存活百分数。 七、裸鼠移植瘤实验 若干只B a l b c 裸小鼠，右侧腋下接种生长良好的肿瘤细胞悬液。待长出 1 5 0 2 0 0 姗3 的肿瘤后，随机分为治疗组及对照组，隔天注射1 次，注射l O 天后， 腹腔注射前药；对照组，腹腔注射P B S 共注射1 0 次。观察裸鼠生存及肿瘤大小， 用游标卡尺测量肿瘤短径( a ) 、长径( b ) ，按公式V = a b 2 2 计算肿瘤体积，按下式计 3 算抑瘤率：抑瘤率= 【( 对照组肿瘤的平均体积- 实验组肿瘤的平均体积) 对照组肿瘤 的平均体积 x1 0 0 结果 肿瘤细胞感染D m d N K 后保持其酶活性。 在肿瘤细胞中自杀基因和D m - d N K 联合效应杀伤肿瘤细胞的效果较单自杀基 因杀伤肿瘤细胞效果明显。 感染D m - d N K 的正常细胞对照可以观察到极低的酶活性，强烈的联合杀伤效 果只在肿瘤细胞中可以观察到。 在动物实验中同样观察到细胞实验中的杀伤效果。 结论 病毒载体携带D m d N K 感染肿瘤细胞后表达其酶活性并磷酸化核苷酸类似 物，将D m d N K 运用于基因治疗治疗肿瘤是有希望并且安全的