喘复康合剂对支气管哮喘大鼠气道重塑和CD44表达的影响【摘要】 目的观察喘复康合剂对支气管哮喘大鼠气道重塑的影响及其可能的作用机制。方法采用卵白蛋白致敏法复制大鼠哮喘模型，以喘复康合剂灌胃给药后，用免疫组织化学法检测各实验组大鼠肺组织中CD44表达的变化；通过图像分析系统测定各实验组大鼠支气管壁各层的厚度；通过Masson三色染色法及图像分析系统测定各实验组大鼠胶原沉积厚度。结果哮喘组肺组织中CD44的含量明显高于对照组（P<0.05），4周组较3周组更为明显；激素组CD44表达不明显，与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。喘复康低、高剂量组CD44的含量明显低于哮喘组（P<0.05）。图像分析结果显示，哮喘组支气管平滑肌明显增厚，胶原沉积增加，4周组较3周组更为明显，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），激素组与喘复康组平滑肌增厚不明显，与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。结论 喘复康合剂能够抑制哮喘大鼠气道重塑的形成，可能是通过减少肺组织中CD44的产生和表达而发挥的，与激素作用结果相似。 【关键词】 哮喘 气道重塑 喘复康大鼠Abstract：ObjectiveTry to observe the effect and possible mechanism of ChuanFuKang mixture on airway remodell of rat models of asthma.MethodsAn animal model of asthma was established by OVA (ovalbumin) sensitizing-challenging SD rat. Water extract of ChuanFuKang were given to rats(ig). Immunohistochemical technology was used to estimate the change of CD44 in the rat lung tissues of each group, the thickness of bronchial wall and the area of collagen deposition was detected by computer image analyse system and by method of Masson trichrome staining.ResultsThe content of CD44 of lung tissue of asthma group was significantly higher than that of control group (P0.05), the four-week group was more obvious than the three-week group. The content of CD44 of low dose and high dose group was obviously lower than that of asthma group(P0.05). The results of the image analysis showed that the thickness of bronchial smooth muscle and the area of collagen deposition obviously increased, the four-week group was more evident than the three-week group, there was significant difference compared with control group(P0.05). These changes of hormone group and ChuanFuKang group were not evident, there was no significant difference compared with control group(P0.05).ConclusionChuanFuKang mixture can inhibite the airway remodeling by reducing the produce and the expression of CD44 in asthmatic rat lung tissue.Key words：Asthma; Airway remodeling; ChuanFuKang Rats 支气管哮喘(简称哮喘)是严重影响人体健康的慢性呼吸道炎症性疾病。近年来，人们针对哮喘病的慢性进行性和难以根治性，对于哮喘气道壁重塑的研究日益受到重视。气道重塑主要表现为气道平滑肌肥大、增生、基底膜增厚和玻璃样变，由此可致气道的不可逆阻塞和持续的气道高反应性，是顽固性哮喘的重要病理基础1。许多因素如炎症介质、细胞因子及原癌基因都参与了这一过程。本研究观察不同时段哮喘大鼠模型肺组织中CD44的表达及药物对其表达的影响，旨在进一步阐明CD44在哮喘气道重构中的作用和药物的干预机制，为进一步的实验研究提供依据。1 材料与方法1.1 药品与试剂 鸡卵清白蛋白（OVA），美国Sigma公司;地塞米松磷酸钠注射液，湖北天药药业；兔抗鼠CD44多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；SP免疫组织化学、DAB显色试剂盒，北京中衫金桥生物技术有限公司。1.2 仪器 402T型超声雾化器，上海四菱医疗器械厂；自制大鼠雾化吸入箱；DC200图象采集系统、IM50型图像采集软件、Image-Proplus真彩色医学图象分析软件，德国Leica公司产品等。1.3 动物及分组 健康雄性SD大鼠80只，体重180200 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验前动物于正常温控、光照和自由摄取食物、水的条件下饲养1周后，被随机分成5组：正常对照组、哮喘组、地塞米松处理组及喘复康低剂量和高剂量处理组。各组又分成诱喘3周、4周两个时间段。1.4 大鼠哮喘模型的建立 采用卵白蛋白（OVA）致敏法制备2。第1天，哮喘组及各给药组大鼠用1ml混悬液腹腔注射OVA 10 mg；Al(OH)3干粉100 mg致敏，第15天开始诱喘，哮喘组大鼠超声雾化1%OVA激发，约30 min/次，观察并记录大鼠呼吸及全身情况，以出现呼吸加快、口周发绀及腹肌痉挛、点头呼吸为激发成功，共2128 d。分别于第35天，第42天处死大鼠。地塞米松组于每次诱喘前1h给予腹腔注射地塞米松1.0 mg/kg。对照组在相同的时间腹腔注射、雾化吸入0.9%生理盐水，其余同哮喘组。 喘复康处方药物由医学院中医内科提供，其主要成分为麻黄、杏仁、丹参、僵蚕、地龙、苏子、白芥子、鱼腥草、黄藤、甘草等。所有药物经浸泡、煎熬、过滤及浓缩成浓度为4 g生药/ml的药汁,将浓缩后的药汁装入已消毒的容器中,密封后再高温灭菌,置于4冰箱保存用。于雾化攻击前给予灌胃给药,低高剂量组分别以50，100 g生药/(kgd) 灌胃。1.5 肺组织病理学观察 末次激发结束后24 h内处死，取右肺中叶组织，修块，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片。行HE染色及Masson三色法染色。1.6 计算机图象分析气道壁厚度及胶原厚度 采用计算机图像分析系统，每张切片在显微镜下(400)，确定完整的支气管横截面，分别选取6个完整的细支气管截面，分别测取支气管基底膜周径（Pbm）、总管壁面积（WAt）、内壁面积（WAi）以及平滑肌面积（WAm），并用Pbm将测量值标化，分别以Wat/ Pbm、Wai/ Pbm及Wam/ Pbm代表相应管壁层的厚度，并计算其平均值。Masson三色染色法使胶原纤维呈绿色，IMG-Q500图像采集系统采集图像，找到完整的支气管横截面，图像分析胶原厚度。1.7 免疫组织化学染色 CD44免疫组化染色采用SABC法。切片脱腊、水化后3%H2O2室温下反应10 min以灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，滴加正常牛血清封闭液，室温10 min。滴加适当稀释（1100）的一抗免抗鼠CD44多克隆抗体，4下过夜，PBS充分冲洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG，37下反应20 min，滴加试剂SABC, 37下反应20 min后DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水充分洗涤。苏木精轻度复染，脱水、透明、封片观察。计算机图象半定量分析系统测取管壁阳性染色的灰度值作相对含量，随机选取6个支气管，图像分析各支气管细胞染色的灰度值。1.8 统计学处理 各组间数据均以(s)表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，各组间比较首先采用方差齐性检验，组间差别采用单因素方差分析及q检验，相关性检验采用直线相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义。2 结果2.1 病理组织学改变 各组肺组织石蜡切片常规HE染色，光学显微镜下发现,哮喘3周组，支气黏膜皱襞增多，上皮脱落，气道平滑肌的厚度明显增加，黏膜下、管壁及肺泡间质均见有大量嗜酸性粒细胞浸润，管腔狭窄；4周组上述改变更加明显。激素组和喘复康合剂组仅有轻度的炎症反应，支气管及肺泡炎性细胞浸润明显轻于哮喘组。Masson三色法染色法结果显示，哮喘组支气管黏膜及上皮下胶原纤维呈绿色，其分布明显增多，4周组较3周组更为明显；激素组和喘复康合剂组上皮下基底膜胶原沉积不明显，与正常对照组相比无显著性差异。见图110。图1 CD44免疫组化染色空白对照（20）（略）图2 正常组CD44免疫组化染色（20）（略）图3 哮喘3周组CD44 免疫组化染色（20）（略）图4 哮喘4周组CD44免疫组化染色（20） （略）图5 地米3周组CD44免疫组化染色（20）（略）图6 地米4周组CD44免疫组化染色（20） （略）图7 低剂量3周组CD44免疫组化染色（20）（略）图8 低剂量4周组CD44免疫组化染色（20） （略）图9 高剂量3周组CD44免疫组化染色（20）（略）图10 高剂量4周组CD44免疫组化染色（20）（略）2.2 各组平滑肌面积及厚度、胶原厚度比较 用支气管基底膜周径标化总管壁面积、内壁面积和平滑肌面积为WAt/ Pbm,WAi/ Pbm及WAm/ Pbm，代表相应管壁层的厚度。哮喘模型组支气管平滑肌明显增厚，胶原沉积增加，4周组比3周组更为明显，与正常对照组及各给药组比较有显著性差异。激素组及喘复康大剂量组平滑肌增厚不明显，与正常对照组相比无显著性差异。见表1。表1 各组不同时期平滑肌和胶原厚度比较（略）与正常对照组比较，P<0.05，与哮喘模型组比较，P<0.05；n=82.3 气道壁CD44免疫组织化学表达改变 气道壁CD44主要表达在气道黏膜上皮细胞胞膜，炎性细胞、肺血管内皮细胞、基底膜、支气管平滑肌未见表达。图像分析结果显示，CD44在正常对照组气道壁弱阳性表达，激发3周时，在哮喘模型组气道黏膜上皮稳定阳性表达，4周时表达更为明显。在喘复康小剂量3周干预组其表达低于哮喘模型组但无显著性差异(P>0.05)，与正常对照组、喘复康大剂量干预组、激素干预组比较均偏高(P>0.05)；激素干预组及喘复康大剂量组CD44表达明显较哮喘模型组低(P<0.05)。见表2。2.4 相关性分析 经直线相关分析得知，气道壁CD44含量与平滑肌厚度呈