高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制药品名称称 量( g )母 液取母液量( ml )配 成 磷 酸 缓 冲 液 (PBS)mlmol/L合并配成稀释1倍NaH2PO41.201000.1851000 ml0.10 mol/LpH 7.82000 ml 0.05 mol/LpH 7.8Na2HPO414.2010000.1915注：配成PBS2000ml，其中1000ml用于A液配制，另1000ml用于酶液制备。1.2 其它溶液配制 代 号 溶液名称配制浓度称取药品量( g )稀释或定容配成量/每样品用量(ml/ml)用于 A 蛋氨酸 (Met) 缓冲液 15 mmol/L Met 2.2383加1000ml pH7.8, 0.1mol/L的PBS 1000 / 2SOD活性测定 B 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液 0.003 mmol/L EDTA 0.0877(1)加100ml 热蒸馏水(2) 再稀释1000倍 1000 / 0.1SOD活性测定 C 核黄素(VB2) 溶液 0.1 mmol/L VB2 0.0038 100 ml 蒸馏水 100 / 0.1SOD活性测定 D 蓝四氮唑 (NBT)溶液 0.1 mmol/L NBT 0.0818 1000 ml 蒸馏水 1000 / 2SOD活性测定 E 三氯乙酸 (TCA) 溶液 10 % TCA 100 1000 ml 蒸馏水 1000 (用于F液的配制)丙二醛(MDA)含量测定 F 硫代巴比妥酸 （TBA）溶液 0.5 % TBA 5 1000ml 10%的 E液 1000 / 2丙二醛(MDA)含量测定2 酶液制备 称取植物材料g，加少许0.05mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml匀浆。转移至10ml离心试管中，在3000 rpm下粗离心分钟，粗提液再转移至2个5ml离心管中，在冷冻离心机13000g、下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD活性和丙二醛含量的测定。3 丙二醛含量测定吸取酶液ml加入液ml沸水浴加热15分钟(呈粉红色)快速冷却4000rpm 下离心分钟。若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。以液为参比液，分别在532nm 和600nm处测定光密度值。丙二醛含量（nmolg-1） 式中：V/v - 提取液总量(10ml)测定液用量(2ml) R - 反应液总量(ml) - 植物材料鲜重或干重(g) 0.155 - 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当MDA=1nmol/ml时,OD532-OD600=0.155) 即( OD532OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml 室温下处理的叶片在523nm出的光密度值次数12345678910平均值OD523-0.006-0.007-0.011-0.012-0.0030.0230.025-0.016-0.0030.012-0.0022室温下处理的叶片在600nm出的光密度值次数12345678910平均值OD600-0.027-0.054-0.054-0.027-0.042-0.027-0.043-0.042-0.042-0.027-0.039室温下丙二醛含量（nmolg-1）= =-0.0022+0.039/0.155410/21=4.75 nmolg-1冷处理下的叶片在523nm出的光密度值次数1234567平均值OD5230.0780.0770.0770.0760.0780.0760.0760.077室温下处理的叶片在600nm出的光密度值次数1234567平均值OD6000.0250.0260.0260.0270.0270.0260.0260.026冷处理下丙二醛含量（nmolg-1）= =0.077-0.026/0.155410/21=6.58 nmolg-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明(1)按照下表加入各种溶液：处 理重复试管编号按顺序加入各种溶液（ml）光密度(560nm)A液B液C液D液水酶液对照植株(处理1)12220.10.10.10.122-0.10.1ODOD胁迫植株(处理2)34220.10.10.10.122-0.10.1ODOD仪器调零液520.10.1-20.1*OD0无酶液 (NBT还原100%)620.10.120.1-ODmax* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。(2)将试管置于阳光下反应15分钟（NBT还原产物为蓝色），然后在560nm下测定光密度(OD560)。(3)若样品反应后蓝色很浅或无，则须减少酶液用量后，再重复上表步骤；若样品反应后蓝色极深或与无酶液同，则须增加酶液用量后，再重复上表步骤。4.2 计算1个酶活单位 定义: SOD抑制NBT还原50% 时的酶液用量(ml)。SOD活性(u/g) 式中：u - 1个酶活单位 (ml)V - 提取液总量 (10 ml)v - 测定酶液用量 (0.1 ml) - 植物材料鲜重或干重 (g)5 问题与讨论5.1在自然光照下，蓝色几乎立即生成，至15分钟时基本稳定。但随照光时间延长，酶会失活，蓝色渐退。故照光时间以15 分钟为好，不宜再长。5.2 光质、光强、时间、温度、试管质地等因素均对结果产生影响，应尽量保持一致。5.3 酶液用量应使处于合适范围之内，否则须加调整（见4.1(3)）。5.4 酶液在反应液中所占比重较小，对OD影响也小。但如果浑浊、有色，则需考虑其影响。实验2 游离脯氨酸含量的测定（茚三酮法）（操作步骤）1 药品配制1.1 2.5%的酸性茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮加入60 ml冰醋酸加入40 ml 6 molL的磷酸加热溶解冷却贮于棕瓶中备用。（85的浓磷酸约为14.6 molL）。1.2 3%磺基水杨酸：称取3g 磺基水杨酸，溶于100 ml蒸馏水中。2 标准曲线绘制称取0.025 g脯氨酸，定容于500 ml蒸馏水中，配成浓度为50gml的脯氨酸母液。按下表绘制标准曲线：用微量取样器取母液 (l) 100200300400500用微量取样器取水 (l) 1000900800700600500配成1ml Pro标准液浓度(g/ml)0510152025加入冰醋酸 （ml）111111加入茚三酮 (ml)222222加入水杨酸 (ml)111111显色液Pro浓度 (gml)012345在沸水浴中加热显色50分钟冷却至室温测定光密度 ()，以水为参比液3 游离脯氨酸测定3.1提取：称取0.5g植物材料剪碎后放入试管中加6ml 3%磺基水杨酸在沸水浴中提取10分钟 3000rpm离心5分钟。上清液为脯氨酸提取液。3.2测定：提取液ml冰醋酸ml茚三酮ml水ml沸水浴中加热显色50分钟冷却至室温比色测定(以蒸馏水为参比液)查标准曲线得样品中Pro浓度。4 计算脯氨酸含量 (gg) 式中： - 样品比色液的脯氨酸浓度 (gml)，由基于脯氨酸显色浓度的标准曲线查得。 1 - 样品研磨或煮沸提取液总量 (本实验中6 ml) 2 - 显色反应液 (本实验中ml) v - 样品测定汲取液 (本实验中ml) - 植物材料重量 (g)温室处理下次数12345678910平均值0.0360.3700.3520.3500.3500.3630.3730.3620.3620.373脯氨酸含量 (gg) =C65/10.5冷处理下次数12345678910平均值0.8580.8580.8690.8580.8440.8580.8460.8590.8580.8580.857脯氨酸含量 (gg) =C65/10.55 问题讨论5.1若植物材料加热显色后溶液浑浊，可用4ml甲苯萃取，然后比色(标准曲线也相同)。5.2植物样品取样量应视脯氨酸含量而定，并根据经验进行调整，使样品OD位于标准曲线范围之内。5.3公式中没有包含萃取液量(4ml)。若样品测定与标准曲线不同，则必须在计算公式中予以相应表示。实验3 过氧化物酶活性的测定（比色法）一、 原理过氧化物酶广泛分布于植物各组织中。过氧化物酶与植物的呼吸作用、光合作用以及生长发育密切相关。在H2O2存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成的棕红色产物可用比色法予以测定。 O-CH3O-CH34- O CH3 + 4H2O2 = -O-O-O-O- O-CH3O-CH34邻甲氧基苯酚 + 4H2O2 4-邻甲氧基苯酚 (棕色)(愈创木酚) (过氧化氢) （测定波长470nm）二、