项目可行性研究报告项目可行性研究报告 项项 目目 名名 称称 一种减少皮肤色素沉淀的二氢芳基萘类木脂素 化合物外用凝胶的应用研发 1 1 立项的背景与意义立项的背景与意义 1.11.1 立项背景立项背景 黑色素（Melanin）是动物皮肤或者毛发中存在的一种黑褐色的色素，通常 以聚合的方式存在，它主要由皮肤表皮基底层的黑色素细胞产生。黑色素的含 量及分布决定了皮肤的颜色，此外它还能减小紫外线对皮肤的伤害。然而，黑 色素在基底层的异常蓄积会造成色素沉着过度引起黑斑病、雀斑、老年斑、黑 色素瘤等，给人们的生活工作带来困扰，严重的如黑色素瘤还危及生命。该类 皮肤病的治疗一直是皮肤科及医学美容工作者研究的重要课题。 在皮肤黑色素的形成过程中，酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）扮演了重要角 色，它是酪氨酸（Tyrosine）和多巴向黑色素转变过程中的主要限速酶，它的过 量表达是导致色素沉着过度的主要原因。日晒过度、内分泌失调和化妆品使用 不当等，都有可能引起色素沉着过度。临床上对该类疾病的治疗主要从两方面 入手，一种是对因治疗，另一种是对症治疗，后者是采用物理方法或者化学方 法来祛除黑色素，皮肤磨削术、激光疗法和药物治疗是常用的治疗手段。由于 操作相对简单，临床上对色素沉着的治疗多优先以药物治疗入手，治疗中常使 用酪氨酸酶抑制剂来抑制人体内 TYR 的活性，从而阻断黑色素的生物合成反应 链。常用的酪氨酸酶抑制剂有氢醌、曲酸等，但它们存在作用强度弱或安全性 差等缺点，如近年来日本学者研究发现曲酸可能有致癌性，氢醌对皮肤刺激性 较强，会引起灼烧感，长期使用会诱发褐黄病和胶样粟丘疹等。因此，对黑色 素生物合成机制的深入研究及寻找新型高效的酪氨酸酶抑制剂一直是一项重要 的工作。 1.21.2 立项意义立项意义 本项目为寻找新的酪氨酸酶抑制剂，而对黑色素生物合成机制进行深入的 研究，开发了一种对黑色素生物合成的限速酶酪氨酸酶（TYR）有较强的抑制 作用的 VBE-1 凝胶。VBE-1 是一种从黄荆子（Vitex negundo L.）中提取出的二 氢芳基萘类木脂类化合物，化学名为 6-羟基-4-（4-羟基-3-甲氧基苯基）3-羟甲 基-7-甲氧基-3，4-二氢（3R，4S）-2-醛基萘。2006 年，Azhar-ul-Haq 发现， VBE-1 对黑色素生物合成的限速酶酪氨酸酶（TYR）有较强的抑制作用，因此 可能抑制黑色素的生物合成。与常用的酪氨酸酶抑制剂曲酸相比，VBE-1 对 TYR 的抑制作用更强，有望成为一种新型的天然植物源治疗皮肤色素沉着的药 物。课题组前期研究发现 VBE-1 口服生物利用度低，在体内易代谢失活，提示 系统给药不是发挥 VBE-1 抑制黑色素作用的理想途径，将其制成局部外用制剂 是较好的选择。因此，根据 VBE-1 的生物特性，制成 VBE-1 外用凝胶是最为 有效的办法，该凝胶具有制备工艺简单、成本低、易于控制剂量、使用方便、 便于携带的优点，可以满足现有市场对高效的天然酪氨酸酶抑制剂的日益强烈 的需求，具有良好的社会经济效益。 2 2 国内外研究现状与发展趋势国内外研究现状与发展趋势 2.12.1 研究现状研究现状 1）黑色素淡化机理 黑色素其实是一种蛋白质，在每个人的体内都有。它们存在于皮肤基底层 的细胞中间，此时并不是真正意义上的黑色素，而是一种叫“黑色素原生物质” 的物质，也叫做“色素母细胞” 。色素母细胞分泌麦拉宁色素，当紫外线(B 波、 A 波)照射到皮肤上(B 波即 UVB 作用于皮肤基底层，而 A 波更厉害，作用于皮 肤的真皮层)，肌肤就会处于“自我防护”的状态，藉由紫外线刺激麦拉宁色素， 激活酪氨酸酶的活性，来保护我们的皮肤细胞。酪氨酸酶与血液中的酪氨酸反 应，生成一种叫“多巴”的物质，多巴其实就是黑色素的前身，经酪氨酸氧化 而成，释放出黑色素，黑色素又经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层形 成雀斑、晒斑、黑斑等形状了。要减少黑色素沉淀，可以通过两个途径实现： 一种是防止色素的生成；另一种是促使生成的色素的排泄出体外。由于操作相 对简单，临床上对色素沉淀的治疗多优先以药物治疗入手治疗中常使用酪氨酸 酶抑制剂来抑制人体内 TYR 的活性，从而阻断黑色素的生物合成反应链，常用 的酪氨酸酶抑制剂有氢醌、曲酸及其衍生物。由于现有产品有不足之处，加上 美白产品的需求量不断增大，对黑色素生物合成机制与酪氨酸酶抑制剂的作用 机理的深入研究吸引了众多学者的关注；同时，由于开发新型高效的天然酪氨 酸酶抑制剂的市场需求日益强烈，越来越多的学者开始从植物提取物中筛选活 性化合物，比如 Ahmad Gholamhoseinian 曾对 80 种植物进行筛选，发现绿茶、 小茴香等 6 种植物的提取物能有效抑制酪氨酸酶。这类研究将进一步加深人们 对黑色素及其抑制剂的认识，为皮肤的美白提供新的思路。 2）现有主要酪氨酸酶抑制剂 氢醌：是一种白色针状结晶，可溶于 14 倍的水，是一种传统且有效的淡化 黑色素沉淀的成分，它具体凝结蛋白质的作用，通过凝结氨酸酶中的氨基酸， 使酶冻结而失去催活性。但是，氢醌对皮肤刺激性较强，在一定浓度下可致黑 色素细胞变性、死亡，大量使用会引起灼烧感，长期使用会诱发褐黄病和胶样 栗丘疹等。 曲酸：又称为曲菌酸，是目前研究的最为深入的酪氨酸酶抑制剂，它是一 种真菌的代谢产物，常作为美白添加剂和食品添加剂。曲酸在单酚酶活性上表 现出竞争性抑制作用，在双酚酶活性上表现出混合型抑制作用，说明曲酸可以 和游离酶（Emet 或 Eoxy）以及酶底物复合物（EmetD 或 EoxyD）结合。曲酸 5 位羟基和 4 位酮基能与底物竞争酪氨酸酶活性中心上的 Cu2+，从而抑制酶的 活性，使重要中间产物的生成阻断从而抑制了黑色素的生成，它对酶的抑制作 用为可逆过程。曲酸化学式如下图所示： 图图 1-1 曲酸结构式曲酸结构式 由于曲酸对光、热及金属离子不稳定，而且皮肤吸收性较差，人们开发了 大量的曲酸衍生物来改善它的性能，它们的作用机理与曲酸相同。衍生物的开 发主要是对曲酸分子上的两个羟基进行修饰，主要进行的是酯化和烷基化反应。 目前美白产品中曲酸双棕榈酸酯是最流行的曲酸类美白剂，其较曲酸在光、热 稳定性上有很大提高，美白效果更佳，更易被皮肤吸收。然而，曲酸存在安全 性差的问题，近年来日本学者研究发现曲酸可能有致癌性。 多酚类化合物：特指自然界中含多个酚类官能团的化合物，是酪氨酸酶抑 制剂中最大的一类。一些多酚类化合物是酪氨酸酶的底物，其中包括黄酮类化 合物、芪类和香豆素衍生物。黄酮类化合物通过竞争性抑酪氨酸酶对左旋多巴 的氧化来抑制黑色素的生成，比如栎精、非瑟酮等，根据它们的结构推测它们 是以螯合酶活性中心的铜来抑制酶活力。研究显示对该类化合物苯环上的羟基 进行糖基化和甲氧基化修饰能显著影响其抑制强度。芪类包含一个由乙烯基取 代的苄基环，这一类抑制剂在单酚酶活性和双酚酶活性上均表现为非竞争性抑 制剂，它们可减少黑素瘤细胞中的色素沉积，其作用机制是直接抑制酶的活性 而不影响基因的表达。 蒽醌类化合物：它有着非常广泛的药理学活性。研究显示大黄素甲醚对酪 氨酸酶的抑制作用与曲酸类似，而经羟基和甲氧基修饰后，其活性有大幅度提 高 Azhar-ul-Haq 对黄荆子提取物中的木脂素类化合物进行了研究，有 7 个单体 对酪氨酸酶的抑制作用强于曲酸，其中的 VBE-1 抑制强度大约是曲酸的 2 倍， 该化合物的研发已被列为“十一五”重大专项题目，由于黑色素主要在皮肤基 底层产生，药物可能通过滞留在皮肤中发挥药效。 2.22.2 发展趋势发展趋势 综合对淡化黑色素药品的临床研究和市场分析，淡化黑色素类产品将成为 未来临床药品和化妆品发展的重要品种之一，其开发、研究将会成为全球尤其 是亚洲临床研发关注的重点。今后此类产品的发展将会呈现如下趋势： （1）为了实现长期使用、安全、高效的理想，研究人员将在改善现有减少 色素沉着产品成分不足的基础上，不断开发新型减少黑色素沉淀成分，以满足 不断增长的临床需求； （2）天然提取淡化黑色素的药品会有所增加，实践证明，一些天然成分具 有很好的淡化黑色素的效果，且安全可靠，世界各国植物药资源丰富，中草药 因其药效温和、副作用小而被广泛认同，回归大自然的思想具有较好的市场号 召力，天然酪氨酸酶抑制剂的开发将成为未来一个备受瞩目的课题。 3 3 项目实施主要内容、技术关键与创新点、预期目标项目实施主要内容、技术关键与创新点、预期目标 3.13.1 实施主要内容实施主要内容 1、项目实施主要内容、项目实施主要内容 A、已研究开发内容 1）处方前研究：建立 VBE-1 的分析方法，考察 VBE-1 的溶解度及油水分 配系数。 VBE-1 的基本理化性质能影响其在皮肤内的转运能力，也是制剂处方设计 的基础和质量控制的依据。本项目建立了 VBE-1 的 HPLC 分析方法，考察了 VBE-1 在一些非水溶剂和水性溶剂中的溶解度以及在正辛醇-水和正辛醇-缓冲 盐体系中的油水分配系数，并用 UV 法考察了 VBE-1 的 pH 稳定性，用荧光法 推测了其结构变化，为药物的处方设计提供参考。 结果显示，VBE-1 在非水溶剂中的溶解度由大到小依次为：PEG- 4001，2-丙二醇RH-40MCTIPM，在水性溶剂中的溶解度由大到小依次 为：30%PEG-400 生理盐水20%PEG-400 生理盐水10%PEG-400 生理盐水 超纯水生理盐水。VBE-1 有一定的亲脂性，lgP 值为 1.27 左右，pH 值为 4.0-8.0 时，lgP 随着 pH 值的升高而降低。pH 能够改变 VBE-1 的结构，在 5.0-7.2 范围内，VBE-1 在 200-400nm 范围内最大吸收波长处的吸光度值随着 pH 值的 升高而降低，但这种变化可逆。在 pH6 时，VBE-1 能产生荧光，其结构可能 发生了酮式-烯醇互变，其荧光强度随着 pH 值的升高而增强。 2）VBE-1 经皮渗透行为的考察：药物的体外经皮渗透实验是经皮给药系统 开发中用来预测药物经皮渗透的速率，研究介质、处方组成和透皮吸收促进剂 等对药物经皮渗透行为的影响，是药物经皮给药系统有效性和安全性的前提保 障。 本项目建立体外经皮渗透实验方法，采用改良 Franz 渗皮扩散池和离体乳 猪皮肤模型，将 VBE-1 制备成溶液和混悬液后研究其体外经皮渗透规律，探讨 了药物存在形式对其体外经皮渗透行为的影响。 结果显示，溶液和混悬液的稳态渗透速率分别为 1.410.59g/hcm2和 0.690.07g/hcm2，渗透时滞分别为 0.550.09h 和 5.290.71h。两组的 24h 单位面积皮肤累积渗透量和单位质量皮肤累积滞留量有明显差异（P0.05） 。 提示分子状态的药物有更强的能力进入皮肤。pH 值为 5.0 和 7.0 时，溶液中 VBE-1 的 24h 单位面积累积渗透量和单位质量皮肤滞留量无明显差异 （P0.05） ，此现象可能是药物的理化性质和皮肤的缓冲能力共同作用的结果。 以上结果将为处方设计提供指导。 3）VBE-1 凝胶的构建及质量评价：以羟丙甲基纤维素（HPMC）为凝胶基 质，PEG-400 为溶媒，甘油为保湿剂，苯甲酸钠为防腐剂，制备 VBE-1 凝胶， 考察凝胶基质浓度、载药量对 VBE-1 凝胶体外经皮渗透的影响，并对凝胶进行 质量评价。 结果显示，在用量为 1.5%3%时，凝胶的稠度随着 HPMC 浓度的升高而增 大，载药量为 1%的凝胶 24h 单位面积皮肤累积渗透量从 2.840.60g/hcm2 减小到 1.120.75g/hcm2，单位质量皮肤累积滞留量从 10.712.27g/g 减 小到 7.480.78g/g。提示凝胶稠度的增加会阻碍药物的经皮渗透。HPMC 用 量为 1.5%时即可满足涂展要求，制得的凝胶为均匀、细腻、稠度适宜的黄色半