第七章 亲和层析,2,第七章 亲和层析,第一节 概述,3,第七章 亲和层析,7.1.1基本原理,原理,酶与底物；酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子； 抗原与抗体； RNA与互补的DNA分子或片段； 都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。 亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。,4,第七章 亲和层析,7.1.1基本原理,定义,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。,5,第七章 亲和层析,7.1.1基本原理,特点,过程简单、迅速，且对分离含量极少的组分分离效率高 可用于稀溶液的浓缩 条件温和，保持活性 但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。,6,第七章 亲和层析,7.1.2亲和层析的分离过程,根据目标分子选择合适的配基； 由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成亲和吸附剂； 将亲和吸附剂填充层析柱，让酶溶液流过层析柱，则目的酶能迅速而又选择件地吸附在亲和吸附剂上； 用适当的溶液进行洗脱，除去非专一性的杂质； 再用浓度高的或亲和力强的配体溶液边行亲和洗脱，酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。,7,第七章 亲和层析,亲和层析（affiuity chromatography）,应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,原理：,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex,8,第七章 亲和层析,第二节 亲和吸附剂,9,第七章 亲和层析,亲和层析的核心是亲和吸附剂，选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括载体和配体的选择、载体的活化、配体与载体的偶联等等。,第二节 亲和吸附剂,10,第七章 亲和层析,7.2.1 载体,7.2.1.1 载体的性质,具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的pH、离子强度等条件下，载体的性质都没有明显的改变。 能够和配体稳定的结合。亲和层析的载体应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变载体和配体的基本性质。,11,第七章 亲和层析,7.2.1 载体,7.2.1.1 载体的性质,载体的结构应是均匀的多孔网状结构，以使被分离的 生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。载体的孔径过小会增加载体的排阻效应，使被分离物与配 体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大孔径的载体，以使待分离物有充分的空间与配体结合。 载体本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。,12,第七章 亲和层析,7.2.1 载体,7.2.2.2 载体的选择,载体应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用； 一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的载体； 其中以琼脂糖凝胶具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用，如Pharmacia公司的Sepharose-4B、6B是目前应用较多的载体。,13,第七章 亲和层析,7.2.3 连接臂,在亲和层析中，由于配体结合在载体上，它在与待分离的生物大分子结合时，很大程度上要受到载体和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于直接结合在载体上的小分子配体非常靠近载体，而待分离的生物大分子由于受到载体的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。,14,第七章 亲和层析,解决这一问题的方法通常是在配体和载体之间引入适当长度的“间隔臂”，即加入一段有机分子，使载体上的配体离开载体的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。一般68个甲基。 疏水性连接臂会对样品产生非特异性吸附，若非必要，应尽量避免接入连接臂，或选择可自动引入连接臂的活化方法，或选择接好连接臂的商品化载体。,7.2.3 连接臂,15,第七章 亲和层析,7.2.4 配体的选择,7.2.4.1 配体的性质及选择,配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。,16,第七章 亲和层析,7.2.4 配体的选择,7.2.4.1 配体的性质及选择,配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。,17,第七章 亲和层析,7.2.4 配体的选择,7.2.4.1 配体的性质及选择,配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。 完全满足上述条件的配体实际上很难找到，在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。,18,第七章 亲和层析,7.2.4.2 配体的类型,根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体和通用性配体。,7.2.4 配体的选择,19,第七章 亲和层析,7.2.4.2 配体的类型,特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。 如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。,7.2.4 配体的选择,20,第七章 亲和层析,7.2.4.2 配体的类型,通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体， 如各种凝集素可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。,7.2.4 配体的选择,21,第七章 亲和层析,7.2.5 亲和吸附剂的制备,选择好合适的载体、配体后，就可以制备固定化亲和吸附剂。 固定化过程包括： 载体活化（适当的化学方法）； 与配体共价偶联； 封闭裸露活化基团。 详见教材图,22,第七章 亲和层析,7.2.5 亲和吸附剂的制备,7.2.5.1 载体的活化与偶联,载体的活化是指通过对载体进行一定的化学处理，使载体表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 活化后的载体结构如果非常稳定，可保存很长时间后再进行偶联； 如果活化后的载体不稳定，应立即进行偶联。载体活化后可将配体直接偶联上去，也可先在载体上接入一连接臂后再进行偶联。 下文主要介绍载体的活化。,23,第七章 亲和层析,7.2.5.1 载体的活化与偶联,多糖载体的活化,多糖载体尤其是琼脂糖是一种常用的载体。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多，下面介绍一些常用的活性基团及活化方法。,24,第七章 亲和层析,7.2.5.1 载体的活化与偶联,多糖载体的活化溴化氰活化,溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。 溴化氰活化的载体可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰活化的载体通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。,25,第七章 亲和层析,缺点是溴化氰活化法的载体和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使载体可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的载体与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。通过实验条件的不断改进，这些缺点可以得到一定程度的控制。,7.2.5.1 载体的活化与偶联,多糖载体的活化溴化氰活化,26,第七章 亲和层析,7.2.5.1 载体的活化与偶联,多糖载体的活化环氧乙烷基活化,这类方法活化后的载体都含有环氧乙烷基。 优点是活化后不引入电荷基团，而且载体与配体形成的NC、OC和SC键都很稳定，所以配体与载体结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。 缺点是用环氧乙基活化的载体在与配体偶联时需要碱性条件，pH为913，温度为2040 C。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。,27,第七章 亲和层析,7.2.5.1 载体的活化与偶联,聚丙烯酰胺的活化,聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。,28,第七章 亲和层析,7.2.5.1 载体的活化与偶联,多孔玻璃珠的活化,对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。,29,第七章 亲和层析,7.2.5 亲和吸附剂的制备,7.2.5.2 裸露活化基团的封闭,目的：亲和吸附剂固定化后，会残存一些未能和配体偶联上的活化基团，可能导致对待分离组分的非特异性吸附,防止产生非特异性吸附 方法：通过化学反应消除基团上的电荷 常有Ph8.0的乙醇胺、巯基乙醇。,30,第七章 亲和层析,7.2.5 亲和吸附剂的制备,7.2.5.3 配体浓度的估计,测定偶联上的配体的量 判断偶联是否成功及偶联的效率。方法： （1）氨基或羧基可用酸碱滴定。 （2）有紫外吸收特征的,可用紫外分光法测定。 （3）通过测定反应余液中配基残留量推算(偶联率较高的情况) （4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定,31,第七章 亲和层析,第三节 亲和层析实验技术,32,第七章 亲和层析,第三节 亲和层析实验技术,亲和层析的操作过程大致与凝胶过滤层析、离子交换层析相似，典型过程：装柱、平衡、加样、洗脱、再生。,33,第七章 亲和层析,Figure 1. Loading affinity column.,34,第七章 亲和层析,Figure 2. Proteins sieve through matrix of affinity beads.,35,第七章 亲和层析,Figure 3. Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly.,36,第七章 亲和层析,Figure 5. Wash off proteins that bind loosely.,37,第七章 亲和层析,Figure 6. Elute proteins that bind tightly to ligand and collect purified protein of interest.,38,第七章 亲和层析,7.3.1 样品制备,样品量少，比较纯，直接上柱，无需预处理； 样品量大，杂质相对较多，盐析、离子交换等预处理； 复杂样品，细胞碎片、发酵产物等，离心、过滤预处理。,39,第七