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风疹诊断标准及处理原则前 言风疹是由风疹病毒引起的急性呼吸道传染病,呈世界性分布,在我国归属于法定丙类传染病,一年四季均可发生,以冬春季发病为多,易感年龄以 15 岁为多,故流行多见于学龄前儿童。自风疹疫苗问世以来,发病率明显下降。风疹临床症状轻微,但孕妇妊娠早期初次感染风疹病毒后,病毒可通过血胎屏障进入胎儿,常可造成先天性胎儿畸形、死胎、早产,因此,风疹的早期确诊及预防极为重要。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准由浙江医科大学传染病研究所、中国预防医学科学院病毒学研究所负责起草。 本标准主要起草人:刘克洲、张礼璧。本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院负责解释。1 范围本标准规定了风疹的诊断标准及处理原则。本标准适用于各级各类医疗、保健机构、卫生防疫机构和人员对风疹病人的诊断、报告和处理。2 诊断原则典型病例可根据临床表现结合流行病学作出临床诊断,不典型病例需根据血清风疹抗体的检测或风疹病毒的分离阳性予以确诊。3 诊断标准31 风疹311 流行病学史与确诊的风疹患者在 1421 天内有接触史。312 临床症状3121 发热。3122 全身皮肤在起病 12 天内出现红色斑丘疹。3123 耳后、枕后、颈部淋巴结肿大或结膜炎或伴有关节痛(或关节炎) 。313 实验室诊断3131 咽拭子标本分离到风疹病毒(见附录 A) ,或检测到风疹病毒核酸。3132 1 个月内未接种过风疹减毒活疫苗而在血清中查到风疹 IgM 抗体(见附录 B) 。3133 恢复期病人血清风疹 IgG 抗体滴度较急性期有 4 倍或 4 倍以上升高,或急性期抗体阴性而恢复期抗体阳转(见附录 B) 。314 病例分类3141 疑似病例:具备 3122 条,同时伴 3121 或 3123 条。 3142 临床诊断病例:疑似病例加 311 条。3143 确诊病例:疑似病例加 3131 或 3132 或 3133 条。32 先天性风疹综合征321 临床表现3211 新生儿白内障先天性青光眼,先天性心脏病,听力缺损,色素性视网膜病,唇裂腭裂,头小畸形,X 线骨质异常。3212 紫癜、脾肿大、黄疸、精神性迟缓、脑膜脑炎。322 经实验室确诊患儿母亲在妊娠早期有风疹病毒感染史323 实验室诊断3231 婴儿血清风疹 IgM 抗体阳性。3232 婴儿风疹 IgG 抗体水平持续存在,并超过母体被动获得的抗体水平(4 倍以上)。3233 婴儿咽拭子、血、尿、脑脊液或脏器活检标本分离到风疹病毒或检测到风疹病毒 RNA。324 病例分类3241 疑似病例:具备 3211 任一条或可伴 3212 任一条。3242 临床诊断病例:具备 3211 任一条或可伴 3212 任一条,同时伴322 条。3243 确诊病例:临床诊断病例加 3231 或 3232 或 3233 条。4 处理原则41 病人的隔离与治疗发现风疹疑似或诊断病例,应立即隔离,一般隔离至出疹后 5 天。一般接触者不进行检疫。对病人进行对症处理和支持治疗。先天性风疹综合征患儿根据病症专科治疗。 确诊有风疹病毒感染的早期孕妇,为防止可能产生胎儿先天性畸形,建议及时终止妊娠。42 预防孕妇风疹对育龄妇女,宜进行婚前或孕前检查血风疹 IgG 抗体,如证实为易感者,均应接种风疹疫苗。孕妇妊娠早期(3 个月内)尽量避免同风疹病人接触。如一旦接触,可在潜伏期内查血清风疹 IgG 抗体,若阳性表明既往曾有过风疹病毒感染,若阴性应继续在接触后 1 个月左右再测一次血清 IgG 和 IgM 抗体,若明确阳转可判为风疹病毒感染。43 免疫预防预防风疹有效方法是接种风疹减毒活疫苗,可对易感人群实行接种。附录 A(标准的附录) 病原学诊断方法A1 病毒分离从病人呼吸道采集标本分离病原体。A11 标本收集风疹病人宜在出疹前 45 天至疹后 12 天取咽拭子标本。先天性风疹综合征患儿除咽拭子标本外,亦可于出生后尽快取尿液、眼泪、脑脊液、骨髓等标本。将灭菌棉棒稍蘸液体(2牛血清 Eagle 液) ,反复涂抹患者咽部数次,然后将棉棒浸于上述标本液(115mL)中反复挤压,标本液中加足量抗生素(青、链霉素 1000umL)及制霉菌素 50gmL(或二性霉素 5gmL ) 。A12 接种取 0102mL 标本液接种于生长在试管中的单层原代乳兔肾细胞(PRK) (或其他原代细胞如原代人胚肾、兔胚纤维细胞、人胚二倍体细胞等)上,置 37吸附 12h 后弃液,再加入含双倍常规抗生素量的维持液 1mL,置 33培养,每隔 4 天换液,连续观察 814天。如无细胞病变可见,即置30冻化 3 次,盲目传代。每次传代可接种于 RK(下标始)13(下标终) 、Vero、BHK(下标始)21( 下标终)、LLCMK(下标始)2(下标终)细胞上,连续盲传 3 代。A13 观察细胞病变一般于 10 天左右出现细胞病变。若不出现病变,可在接种 14 天后用 100TCID(下标始)50(下标终) 的 ECHO(下标始)11(下标终) 病毒或一定量的 Sindbis、或 VSV、或脊髓灰质炎病毒攻击,并设正常细胞种毒对照。若对照出现病变,接种标本管无病变,表示原接种的细胞内已有病毒感染的存在。A 14 毒株鉴定用已知风疹病毒免疫血清,观察能否与新毒株起作用,传统用中和试验、血凝抑制试验或采用免疫荧光法作病毒鉴定等。A2 病毒核酸检测利用分子杂交技术或 PCR 技术检测风疹病毒核酸。附录 B(标准的附录)血清学诊断方法B1 血凝抑制试验B11 原理鹅红细胞(或鸽红细胞)上有风疹病毒受体,遇风疹病毒可产生凝集现象。若将抗体与病毒(血凝素)预先温育后再加入红细胞则不产生凝集,称为血凝抑制。定量血凝素与不同稀释度抗体(血清)作用后能完全抑制血凝的最高血清稀释度,即为血凝抑制抗体效价。 B12 主要材料B121 血凝板:612 或 812 个圆形孔(孔底光滑)的 U 形板。B122 定量移液器:定量移液器选用 25L(即 0025mL ) 。B123 尖底小试管:形如离心管,便于血清的吸取。B13 风疹血凝素的制备取毒种感染 BHK(下标始)21(下标终) 细胞或 Vero 细胞,常规换液培养。末次换入 2牛血清 199 综合培养基,置 33培养 67 天以上,待细胞病变十十十时收获,冻化,取上清液用 Tween80 乙醚处理即为血凝素;如用白陶土处理的 2牛血清配制感染细胞的培养基来制备血凝素,则不用 Tween80 乙醚处理。B14 血凝滴度所用溶液一律置 4预冷,微量塑料板法。血凝素用葡萄糖明胶巴比妥缓冲液以 12倍比递增稀释,再加 025新鲜鹅红细胞(或鸽红细胞)悬液,混匀,置 4至少 1h,观察结果,以“” (4 单位)的最高稀释度为血凝滴度。B15 血凝抑制试验原血清 01mL07mL 氯化锰肝素液,4作用 20min 后在 18 稀释的血清中加 1 滴积压鹅红细胞(或鸽红细胞) ,1h 内摇 23 次,置 4过夜,再以 2000rmin 的速度离心10min,取上清液待检。待检血清用 pH62 的葡萄糖明胶巴比妥缓冲液倍比稀释后,每孔加 0025mL 血凝素(含 4 单位;如系 pH9 的血凝素,事先应用 01molL 盐酸调至 pH62 左右再用) 。抗原抗体在 4作用 1h 后加入 025鹅红细胞 1 滴(0025mL) ,在 4下作用 2h 后判定结果,以完全抑制血凝为终点。每次试验预设以下对照:阳性血清对照:应出现一定已知效价阴性血清对照:应出现阴性结果待检血清对照:应无非特异性凝集抗原对照:应出现(4 单位) 、(2 单位) 、(1 单位) 、(12 单位)的凝集现象血球对照:应为阳性HI 抗体阳性标准判定以 116 作为阳性标准。葡萄糖明胶巴比妥缓冲剂(DGV)配制:巴比妥 058g巴比妥钠 038g明胶 06g无水 CaCl(下标始)2( 下标终) 002gMgSO4(下标始 )4(下标终)H(下标始)2(下标终)O012gNaCl 85g葡萄糖 10g巴比妥与明胶可分别先各在 250mL 蒸馏水中加温溶解,然后依次加入其他药品,溶解后加双蒸水至 1000mL,分装 10 瓶消毒。用前以 01molL 盐酸将 pH 调至 62,用于稀释待测血清、配制血凝素及红细胞。氯化锰肝素液配制MnCl(下标始)2(下标终) 396g 肝素 16 万单位加双蒸水至 100mL,使用时以双蒸水稀释 4 倍(13) 。B2 酶联免疫吸附法检测风疹 IgG 抗体(ELISA 间接法) B21 原理将风疹抗原包被于固相载体上,加上待检血清,再用酶标抗抗体间接检出特异性抗体。B22 材料B221 聚苯乙烯酶标板。B222 风疹阴性和阳性血清。B223 风疹抗原。B224 抗入 IgG 辣根过氧化物酶结合物。B225 酶底物邻苯二胺双氧水。B23 操作程序B231 用 pH96 碳酸盐缓冲液稀释风疹抗原与未感染风疹病毒的细胞抗原(对照抗原)。B232 于 40 孔聚苯乙烯板的单排孔与双排孔分别加入 01mL孔的风疹抗原与对照抗原。右下最后一孔不加任何抗原作为空白对照,4过夜。B233 以 005Tween 20 生理盐水(NST)洗板三次,倒去洗液。B234 在血凝板中以 2牛血清 NST 将待测血清稀释成 1:201:1280 四个稀释度,每个稀释度加风疹抗原与对照抗原各 1 孔(01mL,下同) ,轻轻振摇后置 3712h。B235 以 NST 洗三次,倒去洗液后每孔加入以 2牛血清 NST 稀释的抗人 IgG 辣根过氧化物酶结合物 01mL(空白对照不加) ,置 3712h。B236 以 NST 洗三次,倒去洗液后加邻苯二胺双氧水底物液,每孔 01mL(包括空白对照孔) ,避光在 37放置 1020min,随时观察,待对照孔开始显淡黄色时即用2molL 硫酸终止,每孔加 50L。B237 用空白对照孔调零点,以酶标仪(492nm )测定各孔 OD 值。OD 值不足 005者按 005 计。凡同一稀释度下风疹抗原孔 OD 值对照抗原孔 OD 值21 即 PN 为阳性。阳性之最高稀释度的倒数即为该血清的抗体效价。小于 120 者视为阴性。B238 每次实验应作已知效价的阳性及阴性血清对照。B3 酶联免疫吸附法检测风疹 IgM 抗体(抗体捕捉 ELISA 法)B31 原理利用包被在固相载体上的抗人 IgM 链抗体,捕捉待检血清中的 IgM,再用风疹病毒抗原和已知的酶标风疹病毒抗体去检测血清中 IgM 是否为抗风疹抗体。利用底物使酶显色而测知。B32 材料B321 聚苯乙烯 40 孔或 96 孔板。B322 抗人 IgM 链抗体。B323 风疹病毒抗原和正常对照抗原。B324 抗风疹病毒抗体(单克隆或多克隆) 。B325 酶标抗抗体:抗风疹病毒抗体和酶标抗抗体也可用酶标抗风疹病毒抗体代替。B326 酶底物邻苯二胺及双氧水。B327 已知的风疹 IgM 抗体阳性和阴性血清。B328 包被液:005molL 碳酸盐缓冲液(PH96)无水碳酸钠 159mg碳酸氢钠 293mg,使用不超过 2 周蒸馏水 加至 100mLB329 洗涤液(NS T ): 085盐水的吐温液氯化钠 17g吐
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