高速逆流色谱 High Speed Counter Current Chromatography,一 高速逆流色谱技术简介,逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层析的方法，将不同溶质分离。逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱，经历了近60 年的历程，技术和设备均已日益成熟，现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。,正相色谱:硅胶、氧化铝等吸附剂固定相 反相色谱：键合固定相，ODS 凝胶过滤色谱：多孔凝胶 离子交换色谱：离子交换剂 薄层色谱：硅胶、氧化铝,逆流色谱:两个互不混溶的溶剂逆向流动,样品在两相之间分配,利用组分在两相分配差异进行分离。 不用固态固定相的全液态的色谱方法 逆流色谱优点： （1）不存在样品的不可逆吸附；样品定量回收 （2）极大地抑制了样品的变性，样品不会遭到破坏,1 逆流色谱原理及发展过程 分配定律：Nernst, 1891 年 K= Cs/Cm 分配系数=溶质在固定相中浓度/溶质的流动相中浓度 两组分分配系数相差较大：一次萃取可得到分离 较小：多次萃取,缺点：多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化， 溶剂耗量大，分离时间长。,逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术 （非连续性）,逆流分配的行列中一个独立单元的示意图,发展历史,1000支管的自动分配行列,在Craig机器中500支管转移后分配系数从0.1到10的溶质的理论分布曲线,旋转腔室逆流色谱 回旋腔室逆流色谱 螺旋管柱逆流色谱仪 1981年，日本的Yoichiro Ito先生，在NIH，Bethesda, Maryland, USA, 在旋转聚四氟乙烯螺旋管离心法基础上研制了一种新型的逆流色谱仪器。 同步行星式运动,特点：（1） 基于流体动力学原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）,（2） 通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场， 保留两相中的其中一相作为固定相,（3）通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率，1000rpm旋转时可达到17次/s频率的萃取过程。,a 多层盘绕管；b 平衡物,上海同田生物 TBE300BAKTA Prime,技术参数 电 源： 220V 20V 50 0.5HZ 主机功率： 200 W 主机容量: 260ml 进样体积:20ml 主机尺寸：563638368mm 转速范围：0-1000 转/分 分离转速：700-1000 转/分（无级变频调速） 流速范围:0.1-30ml/min 分离流速：2.0-4.0ml/min； 压力:0-2MPa 紫外检测器波长：使用汞灯 - 滤光片选择 254 、 280nm ( 标配 ) 多种滤光片可选： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 选购 ) 温控模块（接循环水浴）：温度调控范围 15 40 ，精度 0.5 ， 温控循环液量 1 10 L /min,2 高速逆流色谱原理,利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相，利用恒流泵连续输入另一相，溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。,高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱。图 1 是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。上图，在达到稳定的流体动力学平衡态后，柱中呈现两个截然不同的区域：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域（混合区）呈现两相的激烈混合。其余区域（静置区）两溶剂相分成两层：较重的溶剂相在外部，而较轻的溶剂相在内部，两相形成一个线状分界面。下图，I 到IV 的展开柱，分别与上图中I 到IV 位置相对应，每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动（与海面波的运动相似）。,螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配,在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱以800rpm 旋转时，频率超过13 次/秒，流动相则不断地穿过固定相。所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内，仍有相当高的分配效率。,最初的HSCCC只有一个分离柱，用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破多个分离柱：不用配重，性能和实用能力大大提高。 分析型和半制备、制备型三大系列。 制备型HSCCC，柱容积可达1000,5000 mL，一次最多进样可达几十克粗品。,优缺点（与HPLC等液-固色谱技术比较),优点 分离原理不同：互补性强 无需固体作固定相 ：不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗（HPLC的1/10以下），运行使用的后续投入较低 溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化 色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负载能力强，制备量大，重现性好 盘管总体积100mL， 一次分离量：0.5-2克 盘管总体积3000mL，一次分离量：15-60克,缺点 分离效率（理论塔板数）还不高（1000) N=5.54(tR/W1/2)2 一次分离所需时间还较长（以小时计） 基本原理以及溶剂系统选择等还不完善 相应的配套检测器还不够完善（溶剂干扰） 分离后样品的纯度还需HPLC等方法测定 混合溶剂的回收,高速逆流色谱应用：,旋转速度 在逆流色谱中，留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素，一般说来，高保留量会大大改进峰分离度。研究表明，螺旋柱的旋转速度对两相溶剂在流体动力学平衡时的体积比影响很大。图2 为旋转速度与两相在柱中的保留率的相关曲线。,2. 溶剂体系选择 要用逆流色谱系统进行成功分离，选择适宜的溶剂系统非常重要。好的溶剂系统至少具备两个条件： a) 溶剂可分层。这是最基本的要求，分层的两相（比重轻的为上相，重的为下相），一相为固定相，另一相为流动相。 b) 被分离物质的分配系数（K）范围在0.5-2。K=Cu/CL，Cu是上相中溶质浓度，CL是下相中溶质浓度。K0.5 会导致峰分离度的下降，而K2，会使保留时间太长，样品峰过宽。,表 1 中列举了常用的溶剂系统。查找溶剂系统可以从左边所示的氯仿溶剂系统开始，当氯仿/甲醇/水（2:1:1）溶剂系统的分配系数K 在0.2和之间5 时，通过进一步调整每个成分的比例、用乙酸代替甲醇和/或用四氯化碳（或二氯甲烷）部分代替氯仿，可以获得期望的K 值。如果样品非常不均匀地进入其中一相，氯仿溶剂系统不适合，必须查找具有更广疏水性和极性的溶剂系统，如表右边所列。 当样品大部分进入氯仿溶剂系统的非水下相，应该用正乙烷/乙酸乙酯/水（1:1:1:1）这个疏水性稍强一些的溶剂系统，表中以向上的剪头标明。如果样品仍然大部分进入非水上相，应该进一步向上查找，如果样品更多的集中在下相水相，则向下查找。如果已经到了顶部溶剂系统正乙烷/甲醇/水（2:1:1），仍然显示需要更强疏水性的系统，可以减少水量和/或用乙醇代替甲醇进一步调整溶剂的成分。,另一方面，如果样品大部分进入氯仿系统的上相，应该向相反的方向查找，向下的剪头指向极性溶剂系统。如果极性最大的溶剂系统正丁醇/水（表底）中样品仍大部分进入底水相，可以增加少量某种酸和/或盐来调整丁醇溶剂系统。,溶剂选择在高速逆流色谱中的重要性,分离度Rs: 2(tR2- tR1)/W1+W2 提高分离度的方法 CCC &CPC: (tR2- tR1), HPLC: W1+W2,溶剂系统的选择与优化 步骤1:采用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈（100:00:100）用HPLC对样品进行极性扫描分析 ，得到样品的极性范围,步骤2:溶剂系统的优化 区域 化合物极性 溶剂系统 A 强极性 正己烷/正丁醇/甲醇/水 B 中极性 正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水 C 非极性 正己烷/乙腈 步骤3:溶剂比例的优化 一次只改变一种溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或HPLC测定实验结果,分离方法建立步骤： 1. 根据化合物极性、溶解性特点，结合同类型化合物研究文献，确定备选溶剂系统。 2. 建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。 3. 由所建立的HPLC分析条件准确测定各目标化合物的分配系数。 4. 由分配系数估算相应保留时间，分离度及峰宽等色谱参数。 5. 选择性的选取溶剂系统进行预试。 6. 优化预试条件，确立最佳条件。,HPLC法测定分配系数的理论基础,上海同田生化推荐,在实验之前，先通过文献等各种渠道了解待分离物质的理化性质。常规手段比较难分离的物质的性质、结构差异，通常都会通过结构式了解结构差异，推测分离时可能会需要用什么试剂才能达到分离。例如： 可能会形成分子内羟基的可使用丙酮；含有羟基的可使用甲醇、乙醇等。,一般在了解化合物的性质后通常由三类体系来分离：弱极性体系，中等极性体系，亲水性体系。 弱极性体系：一般指适合分离较容易溶于己烷、石油醚、乙醚、四氯化碳等，也溶于甲醇、乙醇的物质的溶剂体系。通常选用的溶剂条件为：正己烷乙酸乙酯甲醇水；正己烷甲醇水；正己烷乙醇水；四氯化碳甲醇水；正己烷甲醇；正己烷乙腈乙酸乙脂/二氯甲烷等。,弱极性体系溶剂条件筛选模型：,中等极性：一般指适合分离较容易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙醇、丁醇，也溶于甲醇、乙醇的物质的溶剂体系。通常选用的溶剂条件：正己烷乙酸乙酯甲醇水；正己烷乙酸乙酯乙醇水；氯仿甲醇水；氯仿甲醇丁醇水。,中等极性体系溶剂条件筛选模型：,亲水性体系：一般指适合分离容易溶于丁醇、甲醇、乙醇、水等的物质的溶剂体系。一般以乙酸乙脂丁醇/(甲醇)/(乙醇)水；丁醇水；乙酸乙脂丁醇甲醇水等体系。,亲水性体系溶剂条件筛选模型：,HSCCC的应用,1 天然产物 HSCCC使用的溶剂体系的组成是千变万化的，各溶剂的性质也各不相同，因而具有很强的适应性，为从复杂的天然产物中提取有效成分提供了有利条件。因此，国际上HSCCC被大量用于天然产物各类化学成分的分离纯化，如生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素类等，以下为一些成功应用实例： 1.1 银杏 Gingkgo biloba 白果内酯单体 。黄酮苷，纯度达98%以上。 1.2 丹参 Salvia miltiorrhiza 丹参酮IIA(tonshinone II A ) ，丹参酮I（tanshinoneI），隐丹参酮(cryptotanshinone)3。（蒽醌） 1.3 粉防己 Stephania tetrandra 粉防己碱（tetrandrine）、去甲粉防己碱（fangchinoline）和轮环藤酚碱（cyclanoline）。（生物碱） 1.4 黄连 Cotis chinensis 巴马亭（palmatine）、小檗碱（epiberberine）及黄连碱（coptisine）。（生物碱） 1.5 虎杖 Polygonum cuspidatwn 白藜芦醇（resveratrol）、虎杖甙（polydatin）单体 。,1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黄酮） 1.7 苹果 Malus pumila 原矢车菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin B。 1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖) 1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。 1.10 红豆杉粗提物 10-