D 高等哺乳动物的基因转移,第六章 哺乳动物基因工程,C 高等哺乳动物的载体系统,B 高等哺乳动物的受体系统,A 高等哺乳动物基因工程的基本概念,E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白,A 高等哺乳动物基因工程的基本概念,高等哺乳动物基因工程,高等哺乳动物细胞基因表达技术,高等哺乳动物转基因技术,转基因动物个体,动物工程细胞,哺乳动物遗传性状改良,药物筛选研究评价模型,人体基因治疗,蛋白多肽物质大规模生产,药物筛选研究评价模型,B 高等哺乳动物的受体系统,高等哺乳动物细胞的生长特性,高等哺乳动物受体细胞的条件,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,常用的高等哺乳动物受体细胞,高等哺乳动物细胞的生长特性,正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：,锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂,血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长,接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制,形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构,上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代,且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞,会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状,态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。,高等哺乳动物受体细胞的条件,以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件,细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大,遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存,合适的标记 便于转化株的筛选和维持,生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制,规模培养,大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能,安全性能好 不合成和分泌致病物质，不致癌,满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）,次黄嘌呤核苷（HR）,GMP,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途径,嘧啶核苷酸生物合成途径,次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶 核苷激酶,氨基喋呤（AP）,氨基喋呤（AP）,从头合成途径,补救合成途径,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,营养缺陷型的哺乳动物受体细胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）,不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基,上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补,含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞,不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基,上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补,（hprt -）,高等哺乳动物受体细胞的遗传标记,哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记,遗传标记,编码产物,筛选药物,作用机理,APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418,DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤,HPH- 潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素B HPH灭活潮霉素B,TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TR合成TMP,XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP,ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A,常用的高等哺乳动物受体细胞,迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产,的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优,势有如下几个方面：,遗传背景清楚，生理代谢稳定,与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确,基因转移和载体表达系统完善,耐受剪切力，便于大规模培养,被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）,C 高等哺乳动物的载体系统,人腺病毒DNA,猴空泡病毒DNA（SV40）,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人牛痘病毒DNA,人腺病毒DNA,腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个,成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒,腺病毒的生物学特性,有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型,（Ad5）病毒。,腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，,绝大多数的腺病毒成员均能致癌。,人腺病毒DNA,腺病毒的基因组DNA,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有,一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的,表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期,基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒,的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段，,使得载体的装载量提高到4 kb以上。,人腺病毒DNA,基因重排低 外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期,腺病毒DNA载体的特点,安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤,宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格,使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、,VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA。,SV40的生物学特性,SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从,而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。,SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，,便发生非同源整合而致癌。,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40的基因组DNA,t / T基因编码病毒的小抗原和大,抗原与病毒的致癌作用密切相关,SV40在裂解宿主细胞前的晚期,状态时，每个宿主细胞含有105个病,毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效,表达外源蛋白,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建,重组的SV40 DNA分子必须经过,包装后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。为了尽量提,高SV40的装载量，必须删除一些基因,片段，因此重组的SV40分子必须与野,生型病毒共感染受体细胞，才能形成,有感染力的重组病毒颗粒。,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,pBR322,pBR322,SV40,pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其,中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该,载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.,猴多瘤病毒DNA（SV40）,利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序,SV40 载体,病毒晚期基因启动子,筛选标记,ori,缺陷的SV40 辅助病毒,去除细菌序列,插入外源基因,重组分子,分离病毒DNA,转化,筛选,增殖,感染,猴多瘤病毒DNA（SV40）,基因表达好 外源基因能高效表达,SV40 DNA载体的特点,基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象,宿主范围窄 只能转染猴细胞,装载量较小,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因,组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自,人乳多瘤病毒的生物学特性,主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒表达载体的构建,BKV - E.coli 穿梭载体,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的,基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成,穿梭载体，它不能整合，同时也不能,形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。,安装细胞色素P450 dioxin介导的增强,子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。,SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。,以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。,人牛痘病毒DNA,人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细,胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建,人牛痘病毒的生物学特性,出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的,病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外,DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。,人牛痘病毒DNA,目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒，,其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在,人牛痘病毒DNA表达载体的构建,外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大,量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重,组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体,DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。,人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。,人牛痘病毒DNA,利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序,牛痘病毒 启动子,T7 RNA 聚合酶基因,T7启动子,外源基因,细菌重组质粒,感染,转化,培养,收集,D 高等哺乳动物的基因转移,哺乳动物细胞的物理转化法,哺乳动物细胞的病毒转染法,哺乳动物细胞的物理转化法,利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达,盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻,了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随,机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。,哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此,时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；,此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受,体细胞；,磷酸钙共沉淀法,将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37保温4-16小时。,弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。,如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化,效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为,癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。,哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的,样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时,电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在,悬浮液中的淋巴细胞等。,电击转化法,DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。,哺乳动物细胞的物理转化法,将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面,活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。,合，DNA随即进入胞质和核内。,利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa,脂质体介导法,将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融,细胞。,哺乳动物细胞的物理转化法,通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌,鼠，从其输卵管内取出受精卵；,性原