8.3.3 组蛋白的乙酰化及去乙酰化,组蛋白乙酰化是一可逆的动态过程。组蛋白乙酰基转移酶(HAT) 将乙酰辅酶A 乙酰基部分转移到核心组蛋白氨基末端上特定赖氨酸残基的2氨基基团。这些赖氨酸的乙酰化导致电荷的中和以及DNA 与组蛋白的分离,使核小体DNA 易于接近转录因子。在此种情况下,其他因子就可乘虚而入结合于DNA 上。 1. 组蛋白的基本组成,2X (H2A, H2B, H3, H4),2. 核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化 乙酰化：组蛋白乙酰基转移酶 去乙酰化：组蛋白去乙酰化酶,3. 组蛋白乙酰基转移酶（HAT） 目前已发现的HAT有两类： 一类与转录有关 另一类与核小体组装以 及染色质的结构有关。,HAT并不是染色质结合蛋白，但可以通过与其他蛋白相互作用来影响染色质的结构。,组蛋白的乙酰化能中和赖氨酸的正电荷，C=O具有一定的负电，能够增加与DNA的斥力，使得DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。,4. 组蛋白去乙酰化酶 组蛋白去乙酰化酶负责去除组蛋白上的乙酰基团。 目前研究比较深入的是人类中的HDAC1和酵母中的Rpd3。它们都形成很大的复合体发挥作用。,Rpd3能特异性去除组蛋白上的乙酰基团，使核小体相互靠近，并在转录共抑制子Sin3及R的协同作用下，抑制基因转录。,5. 组蛋白的乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响,组蛋白乙酰化的状态与基因表达有关。组蛋白N端“尾巴”上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活性。 相反，组蛋白去乙酰化与基因活性的阻遏有关。 组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶只能有选择地影响一部分基因的转录。,Model for methylation-dependent gene silencing. Acetylation of the histones causes an open chromatin configuration that is associated with transcriptional activity. Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-binding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, converting the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery.,DNA甲基化诱导了组蛋白的去乙酰化作用，使靶基因转录受抑制。,8.3.4 组蛋白甲基化对于真核基因表达的调控,组蛋白甲基化的功能,各种组蛋白甲基化修饰在染色体上的分布以及功能不尽相同,非组成型异染色质化 多发生在不同生长发育时期一些需要被沉默的基因区域。 雌性的随机失活的一条X染色体。,组成型异染色质化 通常发生在染色质中心粒、端粒区域。保持中心粒、端粒的异染色质化。,表观修饰的遗传 通过已经存在的标记招募相应甲基转移酶到染色质附近。,母三色猫的斑驳毛色是X去活化的表现，“黑色皮毛”与“橙色皮毛”的等位基因位于不同的X染色体上。由于x染色体去活化的对象是随机选择，因此不同部位，会依保留活性之染色体的不同，而有不同的毛色。 玳瑁猫,常表达染色质 比异染色质区有更宽松的修饰环境。不同甲基转移酶蛋白和不同磷酸化状态的RNA聚合酶II相互作用，导致两种组蛋白甲基化在基因区的不同分布方式。,启动子解脱 转录区域,修饰的整合作用 多种组蛋白修饰作用不是彼此孤立存在的，它们往往参与同一个基因的表达调控。,2. 组蛋白甲基转移酶,不同的HMT催化不同的底物，酶催化中心的一些关键氨基酸所构成的不同的空间位阻决定该酶能够添加多少个甲基。,3. 组蛋白去甲基化酶,可以脱去组蛋白甲基化的一类酶，主要有LSD1和JmjC家族去甲基化酶两类。 在FAD的参与下, LSD1在体外和体内都可以特异去掉二甲基和一甲基修饰但LSD1去甲基的活性受到底物的限制, 不能去掉赖氨酸的三甲基修饰。 同一个去甲基化酶可以行使转录激活和转录抑制两种相反的功能，视与其合作的因子而定。 JmjC家族去甲基化酶需要铁离子和a-酮戊二酸参与反应，可以去掉赖氨酸的三甲基化修饰。 许多赖氨酸去甲基化酶中的jumonji结构域是酶的催化活性结构域。,RNA干扰及其应用,最早在矮牵牛花中发现此现象 1990，Jorgensen 在矮牵牛花中过表达花青素色素基因 (anthrocyanin pigment gene)以加深花的颜色。 Caused the loss of pigment.,RNAi的发现,Called co-suppression because suppressed expression of both endogenous gene and transgene.,Two mechanisms can explain this transgene-mediated gene silencing Transcriptional gene silencing Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS) mRNA is made, but then degraded,RNAi的发现,RNAi的发现,1995年，Kemphues KJ, Guo S 等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 Cell. 1995, 81 (4): 611-620,RNAi的提出,直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。表格 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。,In 1998 Andy Fire and Craig Mello showed that injections of double stranded RNA was more effective than single stranded RNA in generating mutant phenotypes.,RNAi的提出,RNAi的含义,RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指由双链RNA诱发的基因沉默现象。 其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默 。 与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚至于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。,RNAi广泛存在于自然界,随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。,1、RNAi 机制,体外实验结果的提示,体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。,short-interfering RNA,通过一类较稳定的中间介质实现的。植物：双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。 果蝇：长度为2123nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。 这种小RNA分子被称为小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）。,siRNAs,Long dsRNA,在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成2123nt及3端突出的小分子RNA片断，即siRNA。,随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。,与RNAi有关的蛋白因子,迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。 果蝇RISC中存在Argonaute2(AGO2)因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，即AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶（RNA helicase）也被鉴定为参与RNAi机制的因子。 秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1，这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的。 在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。,RNAi作用的简单模型,当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。,RNAi研究的一般技术路线,2、siRNA 的设计,何为siRNAs,越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将