第二章 蛋白质,本章重点与难点 重点：掌握组成蛋白质的氨基酸的结构特点、分类、三个字母代号及重要理化性质；掌握蛋白质1-4级结构特点、作用力；了解蛋白质结构与功能的关系；了解蛋白质的重要理化性质 难点：氨基酸结构特点、酸碱性质、等电点；蛋白质各级结构的概念和特点、结构与功能的关系；蛋白质重要理化性质的应用。,2.1 蛋白质的组成和分类,2.1.1 概念,蛋白质（protein）是由许多-氨基酸通过肽键相连形成的生物大分子含氮化合物。,2.1.2 蛋白质的存在与功能,2.1.3 蛋白质的组成,C、 H、 O、 N ，大多含有 S 有的还含有P、Fe、I、Cu、Mo、Zn,1. 元素组成,各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，其中N约占16% 。 这可用于测定蛋白质的含量凯氏定氮法。,二. 蛋白质的化学组成,2. 蛋白质的基本结构单元,蛋白质的基本结构单元是氨基酸 多个氨基酸首尾连结形成长而不分支的多聚物多肽链 多肽链再折叠卷曲，形成蛋白质,* 根据蛋白质组成成分,* 根据蛋白质形状,2.1.4 蛋白质的分类,膜蛋白质,氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。氨基连在-碳上的为-氨基酸。天然氨基酸均为-氨基酸。,2.2 蛋白质的组成单位氨基酸,2.2.1 氨基酸的结构通式,组成蛋白质的氨基酸都为 a-氨基酸（除Pro外）,C,酸,氨,不同的 aa 在于 R基团 的不同,组成蛋白质的氨基酸都为 L型（除Gly外）,D型 与 L型,2.2.2 氨基酸的分类,组成蛋白质的氨基酸共有 20 种(不同的氨基酸在于侧链的不同),1. 由侧链R基团的性质,Phe、Tyr、 Trp,Pro、His,Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、 Gln、Lys、Arg 、Ser 、Thr 、Cys 、Met,2. 由aa的营养需求,人类自身能合成,人类自身不能合成或不能足量合成，必须依赖食物供给。,Met Trp Lys Val ILe Leu Phe Thr Arg His “假 设 来 写 一 两 本 书”,Gly Ala Ser Tyr Cys Pro Asn Asp Glu Gln,3. 不常见的蛋白质氨基酸,通常是常见氨基酸的衍生物。 如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸,以游离或结合态存在于细胞或组织中，大部分是常见氨基酸的衍生物或异构型。如存在于细菌细胞壁肽聚糖内的D-谷氨酸和D-丙氨酸、花生中的g-亚甲基谷氨酸、甘蔗中的b-氨基丁酸，刀豆中的刀豆氨酸等。,4. 非蛋白质氨基酸,鸟氨酸 (Orn),瓜氨酸,（1） 两性解离和等电点,2.2.3 氨基酸的理化性质,氨基酸同时含有氨基和羧基： 氨基具有碱性，羧基具有酸性,等电点 (isoelectric point),使氨基酸净电荷为零时溶液的pH值，用 pI 表示,此时，aa 以两性离子形式存在，也有少量的数目基本相同的正、负离子存在，还有极少量的中性分子,pI 是氨基酸的特征常数,等电点的计算,例 Gly 的pI 计算,pI = 1/2 ( pK1 + pK2 ),等电点的计算,例 Glu 的解离,pI = 1/2 ( pK1 + pK2 ),等电点的计算,氨基酸 等电点的计算公式,pI = 1/2 ( pKn + pKn+1 ),( 其中n为可解离的正电荷基团数目 ),Conclusion,pH pI 带负电，移向正极,pH pI 带正电，移向负极,pH = pI 不带电，不移动,（2）氨基酸的化学性质,茚三酮反应,反应分2步：,茚三酮反应常用于aa的定性和定量分析,1）与水合茚三酮反应,Pro的茚三酮反应呈黄色,氨基酸的甲醛滴定法,OH-,中和滴定,2）与甲醛反应,在弱碱溶液中，氨基酸的-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB) 反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。,DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯，所以可以用乙酸乙酯抽提并将抽提液进行色谱分析，再以标准的DNP-氨基酸作为对照鉴定出此氨基酸的种类。此反应最初被Sanger 用于测定肽链 N-端氨基酸,3）Sanger反应,4）Edman反应,Edman反应,此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理,Edam降解法,Edam降解法是一种化学法对蛋白质进行测序的方法，是从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。,蛋白质自动测序仪,Trp、Tyr、Phe 含芳香环共轭双键系统，最大吸收峰分别在 279nm、278nm、259nm。,紫外吸收,（3）氨基酸的光吸收性,除Gly之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性。,旋光性质,（4）氨基酸的光学性质,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,2.3 肽,2.3.1 肽的基本概念和结构,肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,肽链写法：游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。,H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOH,Ser-Leu-Phe,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)： 3个氨基酸组成,存在于几乎每一个细胞的身体。含有巯基的、小分子肽类物质，具有两种重要的抗氧化作用和整合解毒作用，简写为G-SH ），易于碘乙酸、芥子气（一种毒气）、铅、汞、砷等重金属盐络合，而具有了整合解毒作用。,2.3.2 生物活性肽的功能,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,谷胱甘肽 另一主要生理作用是做为体内 一种重要的抗氧化剂，它能够 清除掉人体内的自由基，清洁 和净化人体内环境污染，从而 增进了人的身心健康。,体内许多激素属寡肽或多肽,2. 多肽类激素,促甲状腺激素释放激素(TRH)是下丘脑合成及分泌的一种下丘脑激素，它可以促进垂体促甲状腺激素的合成与分泌。,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),2.4 蛋白质的结构,定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序，也称蛋白质的共价结构。,主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,2.4.1 蛋白质的一级结构,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,一级结构的测定步骤,测定蛋白质的分子质量和多肽链的数目 拆开蛋白质分子的多肽链 断开多肽链内的二硫键 分析每一条多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的N末端和C末端残基 把多肽链裂解成两组以上大小不等的较小片段 测定各肽段的氨基酸序列 重叠各肽段，重建完整多肽链的一级结构顺序 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置,2.4.2 蛋白质的空间结构,蛋白质的空间结构又称为蛋白质的构象或高级结构。是指蛋白质多肽链沿一定方向折叠、盘绕形成的特有空间构象。,（1）稳定蛋白质空间结构的作用力,维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水作用力、氢键、范德华力、盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,a 离子键 b 氢键 c 疏水键 d 范德华引力,主要的化学键： 氢键,（2）蛋白质的二级结构,氢键：与电负性大的原子X（氟、氯、氧、氮等）共价结合的氢，如与负电性大的原子Y（与X相同的也可以）接近，在X与Y之间以氢为媒介，生成X-HY形的键。,） -螺旋, 蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升 一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm， 螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100。, 在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。, -螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。,-螺旋结构的要点如下：,-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。,除了上面这种典型的-螺旋外，还有一些不典型的-螺旋，所以规定了有关螺旋的写法，用“nS”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸的残基数。S为氢键封闭环内的原子数，典型的-螺旋用3.613表示，非典型的-螺旋有3.010， 4.416（螺旋）等。,一些侧链基团虽然不参与螺旋，但它们可影响-螺旋的形成和稳定性,2） -折叠,-折叠也是pauling等人提出来的，它是与-螺旋完全不同的一种结构。, -折叠主链骨架以一定的折叠形式 形成一个折叠的片层。, 在两条相邻的肽链之间形成氢链。, -折叠有平行和反平行的两种形式:, 每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是0.325nm，反平 行的是0.35nm。,(3) -转角 (-turn),-转角是指蛋白质的分子的多肽链经常出现180的回折，在回折角上的结构就称-转角，也称发夹结构。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH之间形成氢键。,4) 凸起,是一种小的非重复性结构，能单独存在，但大多数为反平行-折叠种的一种不规则情况。,5) 无规卷曲,无规卷曲是指没有规律性的肽链结构，但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。,超二级结构(super-secondary structure)是1973年Rossmann提出的，它是指二级结构的基本结构单位（-螺旋，-折叠等）相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。在蛋白质中，特别是球蛋白中，经常可以看到由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成的有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体。 已知的超二级结构主要有，x，-曲折和-折叠筒等。,（3）超二级结构和结构域,：是两个-螺旋互相缠绕，形成一个左手超螺旋。,x：是两段平行的-折叠通过一段连接链x连接而形成的结构。如x为- 螺旋则为；最常见的为两个聚集体连在一起形成 结构，称Rossmann折叠。,Rossmann折叠,如为-折叠，则为。,如x为无规卷曲，则为c。,-曲折（-meander）：,是三条或三条以上反平行的-折叠通过短链，如-转角相连。,-折叠筒（-sheat barrel）：,由多条-折叠链所构成的-折叠片，再卷成一个园筒状的结构。,结构域(structural domain)是 1970年Edelman提出的，它是指在较大的球状蛋白质分子中，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象就是结构域。,最常见的结构域约含100200个氨基酸残基，少至40个左 右，多至400个以上。,结构域是球状蛋白质的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域的缔合。,对那些较小的蛋白质分子来说，结构域和三级结构往往是一个意思，也就是说是单结构域的。一般来说，大的蛋白质分子可以