福建医科大学 硕士学位论文 血清、脐血中FABP4水平变化及胎盘组织FABP4 mRNA表达与子痫 前期发病的关系 姓名：王晓娟 申请学位级别：硕士 专业：妇产科学（围产医学） 指导教师：颜建英 20100501 血清、脐血中F A B P 4 水平变化及胎盘组织F A B P 4m R N A 表达与子痫前期发病的关系 中文摘要 目的 研究重度子痫前期患者血清脂肪细胞脂肪酸结合蛋白( a d i p o c y t ef a t t ya c i d b i n d i n gp r o t e i n ，F A B P 4 A F A B P a P 2 ) 及胎盘组织中F A B P 4m R N A 表达水平变化 与子痫前期发病的关系，探讨血脂代谢和胰岛素抵抗在子痫前期病理生理机制中 的可能作用，并探讨脐血F A B P 4 水平与母血F A B P 4 、胎盘F A B P 4m R N A 表达及新 生儿出生体重的关系。 方法 采用酶联免疫吸附( E L I S A ) 法检测重度子痫前期患者( 病例组：分为发病时 孕周3 4 周的早发型子痛前期组和发病时孕周 3 4 周的晚发型子痫前期组) 、正 常妊娠妇女( 对照组：分为孕周4 3 4 周对照组和孕周 3 4 周对照组) 血清F A B P 4 、 胰岛素及脂联素水平；应用全自动生化分析仪测定血脂、血糖及肾功能。 采用实时荧光定量聚合酶链反应( r e a l t i m eP C R ) 技术检测病例组和对照组 胎盘组织中F A B P 4m R N A 的定量表达水平。 结果 1 病例组血清F A B P 4 水平均高于其同期对照组；校正红细胞压积( H C T ) 后，差 异仍有统计学意义( P 3 4 w e e k so fg e s t a t i o n ) T h ee x p r e s s i o no fF A B P 4m R N Al e v e l si np l a c e n t at i s s u eo fw o m e nw i t hs e v e r e P Ea n dn o r m a lt h i r d - t r i m e s t e rp r e g n a n tw o m e n , w e r ed e t e r m i n e db yr e a l - - t i m e f l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t i o nP C R R e s u l t 1 T h el e v e l so fs e r u mF A B P 4i nt h ee a r l y - o n s e ta n dl a t e o n s e ts e v e r eP Eg r o u p s w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h e i rc o n t r o l s ( P 3 4 周对照组：与晚发型子痫前期孕周相近的对照组3 0 例，平均 年龄( 2 8 9 - + 3 1 ) 岁，孕周( 3 8 6 - + 1 1 ) 周，孕前B M I ( 2 0 4 2 8 ) k g m 2 ， 孕时B M I ( 2 7 0 - + 3 0 ) k g m 2 。 子痫前期的诊断标准参照乐杰主编的五年制第七版妇产科学乜1 ，所有研 究对象均无合并糖尿病、肾病、高血压、心脏病或其他慢性疾病，无急慢性感染 性疾病。所有研究对象均未I 临产，无胎膜早破。对照组孕妇均随访到分娩后，无 妊娠并发症。 所有研究对象均无抽烟、喝酒，饮食与生活习惯无特殊。 ( 二) 、主要试剂和仪器 1 2 1 外周血血清F A B P 4 水平检测试剂 ( 1 ) 酶标包被板9 6 孔板( 用纯化的人脂肪型脂肪酸结合蛋白抗体包被微孔板) ( 2 ) 标准品( 5 4 n g L ) 0 5 m l L l 瓶 ( 3 ) 标准品稀释液1 5 m lX1 瓶 ( 4 ) 酶标试剂6 m lXl 瓶( 5 ) 样品稀释液6 m lXI 瓶 ( 6 ) 显色剂A 液6 m lXl 瓶( 7 ) 显色剂B 液6 m l 1 瓶 ( 8 ) 终止液6 m l 1 瓶( 9 ) 浓缩洗涤液( 2 0 m l 3 0 倍) X1 瓶 2 外周血血清脂联素水平检测试剂 ( 1 ) 酶标包被板9 6 孔板( 用纯化的抗一脂联素抗体包被微孔板) ( 2 ) 标准品( 1 3 5 0ug L ) 0 5 m l L Xl 瓶( 3 ) 标准品稀释液1 5 m lXl 瓶 ( 4 ) 酶标试剂6 m lX1 瓶( 5 ) 样品稀释液6 m lX1 瓶 ( 6 ) 显色剂A 液6 m lX1 瓶( 7 ) 显色剂B 液6 m lX1 瓶 ( 8 ) 终止液6 m lX1 瓶( 9 ) 浓缩洗涤液( 2 0 m lX3 0 倍) 1 瓶 3 外周血血清胰岛素水平检测试剂 ( 1 ) 酶标包被板9 6 孔板( 用纯化的人胰岛素抗体包被微孔板) ( 2 ) 标准品( 3 6 m U L ) 0 5 m l L Xi 瓶( 3 ) 标准品稀释液1 5 m i 1 瓶 ( 4 ) 酶标试剂6 m lX1 瓶( 5 ) 样品稀释液6 m lXI 瓶 ( 6 ) 显色剂A 液6 m lX1 瓶( 7 ) 显色剂B 液6 m lXl 瓶 ( 8 ) 终止液6 m lX1 瓶( 9 ) 浓缩沈涤液( 2 0 m lX3 0 倍) X1 瓶 以上试剂购自美国R & D 公司，所有试剂同批次。 ( 三) 、主要仪器及实验材料 全自动生化分析仪贝克曼L X 2 0 超净工作台( V S - 1 3 0 0 - V )苏州苏净公司 全自动雷杜R a y t o 酶标仪 美国雷杜公司 隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂 洗板机R T - 3 0 0 0美国雷杜公司 一7 0 冰箱美国R E V C O 公司 - 2 0 冰箱、4 冰箱 中国海尔集团 S I G M A 冰冻高速离心机 德国S I G M A 公司 微量孔板震动器德国I K A 公司 二、方法 ( 一) 、血压的测定 对照组行产前检查或入院时休，i f , 3 0 m i n 后，测量其收缩压( S P ) 和舒张压( D P ) ； 病例组入院时，在药物治疗前同法测量其血压，根据S P 和D P 计算平均动脉压 ( M A P ) ，M A P = ( S P + D P X2 ) 3 。 ( 二) 、体重指数( B M I ) 测定 所有研究对象均在明确妊娠后第一次产前检查( 孕周小于1 2 周) 时，测定体 重、身高，计算体重指数B M I ( B M I = 体重( k g ) 身高的平方( m 2 ) ) ，为孕前B M I 口1 ： 所有研究对象均在采集血液标本时测定体重、身高，计算B M I ，为孕时B M I 。 ( 三) 、血清F A B P 4 、脂联素、胰岛素、血脂及血糖的测定 1 标本采集及处理： 所有研究对象均在空腹( 禁食8 h ) 状态下采集肘静脉血，一管5 m l ，立即 送检验科测定T C 、T G 、H D L 、L D L 、A p o A l 、A p o B 、血糖( F P G ) 、C r 及U A 水平。另 一管3 m L ，注入不抗凝的玻璃试管中，室温静置3 0 m i n 后3 0 0 0r m i n 离心1 5 m i n ， 分离血清，置- 7 0 。C 冰箱保存备用。待标本收集完毕，同批测定血清F A B P 4 、脂 联素、胰岛素水平。采血均由专业护士进行，保证所有血液标本无溶血等。 2 血清F A B P 4 水平测定： ( 1 ) 实验检测方法：酶联免疫吸附实验( E L I S A ) ( 2 ) 实验步骤： 标准品的稀释与加样：设标准品孔1 0 孔，在第一、- - - 孑L 中分别加标准品1 0 0 ul ，再各加标准品稀释液5 0pl ，混匀后从第一、- - - 孑L 各取1 0 0I al 移至三、四 孔，再在三、四孔中分别加标准品稀释液5 0u1 ，混匀后在第三、四孔中先各取 5 0pl 弃掉，再各取5 0u 1 移至五、六孔中，如此反复作对倍稀释至第九、十孔， 最后，从第九、十孔中各取5 0 u1 弃掉。 加样：分别设空白孔( 空白对照孔不加样品及酶标试剂) 、待测样品孔。在待 测样品孔中加样品稀释液4 0u1 ，再加样品1 0ul 。混匀后，将反应板置3 7 “ C 温 育3 0m i n 。 洗涤：用洗涤液将反应板充分洗涤5 次，向滤纸上拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂5 0ul ，混匀后，将反应板置3 7 “ c 温育3 0m i n 。 1 4 洗涤：操作同。 显色：每孔加显色剂A 、显色剂B 各5 0pl ，3 7 避光显色1 5m i n 。 终止：每孔加终止液5 0u1 ，终止反应。 测定：以空白孔调零，4 5 0 n m 波长依序测量各孔的吸光度( O D 值) 。 ( 3 ) 结果判断： i 以标准品浓度3 6 、2 4 、1 2 、6 、3 n g L 为横坐标，对应的o D 值为纵坐标，在坐 标纸上绘出标准曲线。 i i 根据样品的0 D 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数5 ，即为样品 的实际F A B P 4 浓度。 i i i ! t 1 标本中待测物质含量过高( 样本0 D 值大于标准品孔第一孔的o D 值) ，稀释 后重测，浓度乘以稀释倍数。 i V 灵敏度：最小可测人脂肪型脂肪酸结合蛋白达2 n g L 。 v 重复性：批内变异系数 3 4 周对照组I 札清F A B P 4 水平 高于孕周3 4 周对照组( P 0 0 5 ) 。见图1 2 、1 3 所示。 IJoEEJ口士 苎| 曼| 一1，10EEoJ- (，IoEE-oJ_ 1 6 0t 7 0 8 01 9 02 0 0 1 4 0I5 01 6 a1 7 0 8 0 g O F A B P 4 ( n o L ) F A B P 4 ( n g I _ ) 图1 2 早发型P E 组血清 图1 3 晚襞型P E 组血清 F A B P 4 与s P 的相关性分析F B F 4 与s P 的相关性分析 ( 3 ) 、| I I L 清F A B P 4 水平与F I N S 、H O M A I R 、B M I 及脂联素的相关性 早发型P E 组、晚发型P E 组血清F A B P 4L j F I N S ( r - O 5 2 8 P - - O0 0 3 ：F O4 2 3 ， P = O0 2 0 ) 、I I O M A I R ( r - O5 6 6 ，P - - O0 0 1 ；r - O5 1 9 ，P - O0 0 4 ) 均呈正相关，与 血清脂联素呈负相关( F04 5 5 ，P - O 0 1 2 ：F 一0 5 6 1 ，P - - O0 0 1 ) ，而与孕前B M I 、 孕时B M I 均无相关性；孕周4 3 4 周对照组血清F A B P 4 与孕前B 眦、孕时B M I 及F I N S 均呈正相关( ：- 04 3 0 ，P - - O0 1 8 ；r - O5 5 5 ，仁0 0 0 1 ：i “ - 04 4 8 ，P = O0 1 3 ) ，孕 周 3 4 周对照组血清F A B P 4 与孕前脚I 、孕时B M I 及F I N S 均呈正相关( 严O5 9 0 ， P - OO