附件1食品中二甲双胍等非食品用化学物质的测定BJS 2019011 范围本标准规定了食品（含特殊食品）中二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍、伏格列波糖、阿卡波糖、维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、达格列净、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、卡格列净、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、曲格列酮、格列喹酮、莫格他唑、GW501516、环格列酮等27种非食品用化学物质的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于茶叶、奶粉、饼干、酒、饮料等食品（包括上述类似基质的片剂、胶囊剂等形式的特殊食品）中二甲双胍等27种非食品用化学物质的测定。2 原理试样粉碎后经甲醇超声提取，过滤后，上清液供高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。3 试剂和材料除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.1.2 甲酸（HCOOH）：色谱纯。3.1.3 甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。3.1.4 甲醇（CH3OH）：分析纯。3.2溶液配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：量取甲酸（3.1.2）1 mL，用水稀释至1000 mL，用滤膜（4.2）过滤后备用。3.2.2 5 mmol/L甲酸铵水溶液：称取甲酸铵（3.1.3）0.315 g，用水稀释至1000 mL，用滤膜（4.2）过滤后备用。3.2.3 5 mmol/L甲酸铵乙腈溶液：称取甲酸铵（3.1.3）0.315 g，加水50 mL溶解后，用乙腈稀释至1000 mL，用滤膜（4.2）过滤后备用。3.3标准品苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍、伏格列波糖、阿卡波糖、维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、达格列净、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、卡格列净、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、曲格列酮、格列喹酮、莫格他唑、GW501516、环格列酮标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量详见附录A中的表A.1，各标准品纯度均95%。3.4标准溶液的配制3.4.1 标准储备液（5 mg/mL）：准确称取伏格列波糖、阿卡波糖、达格列净、卡格列净、曲格列酮、环格列酮各标准品（3.3）50.0 mg（精确至0.0001 g），分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为5 mg/mL标准储备液A，-20保存，有效期3个月。3.4.2标准储备液（100 g/mL）：准确称取苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍、维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、格列喹酮、莫格他唑、GW501516各标准品（3.3）10.0 mg（精确至0.0001 g），分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 g/mL标准储备液B，-20 保存，有效期3个月。3.4.3混合标准中间液A：分别准确吸取伏格列波糖和阿卡波糖的标准储备液（3.4.1）及苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍的标准储备液 (3.4.2)各1 mL，置于同一100mL容量瓶中， 用甲醇（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成混合标准中间液（A），其中伏格列波糖和阿卡波糖浓度为50 g/mL，苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍浓度为1 g/mL。3.4.4混合标准中间液B：分别准确吸取达格列净、卡格列净、曲格列酮、环格列酮的标准储备液 (3.4.1)各1 mL及维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、格列喹酮、莫格他唑、GW501516的标准储备液 (3.4.2)各1 mL，置于同一100 mL容量瓶中， 用甲醇（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成混合标准中间液B，其中达格列净、卡格列净、曲格列酮、环格列酮浓度为50 g/mL，维达列汀等18个化合物浓度为1 g/mL。3.4.5 混合标准工作溶液A：分别准确吸取混合标准中间液A(3.4.3)各0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL，置于20 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，作为系列标准工作溶液S1S5，伏格列波糖和阿卡波糖的浓度均依次为0.25 g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.5 g/mL、5.0 g/mL；苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍的浓度均依次为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。3.4.6混合标准工作溶液B：分别准确吸取混合标准中间液B(3.4.4)各0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL，置于20 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，作为系列标准工作溶液S(1)S(5)，达格列净、卡格列净、曲格列酮、环格列酮4个化合物的浓度均依次为0.25 g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.5 g/mL、5.0 g/mL；维达列汀等18个化合物浓度均依次为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL。4 仪器和设备4.1高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源。4.2分析天平：感量0.0001g。4.3超声波水浴。5 分析步骤5.1试样的制备5.1.1茶叶、奶粉、饼干、片剂、胶囊取适量研细，称取粉末1 g（精确至0.0001 g）置于50 mL量瓶中，加入甲醇（3.1.4）45 mL，振摇，超声提取10 min，放冷，加甲醇（3.1.4）定容至刻度，摇匀，用滤膜（0.22 m，有机相型）过滤，取续滤液，可根据实际浓度适当稀释至线性范围内，供液相色谱-质谱联用仪分析。5.1.2 饮料、口服液准确吸取1 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇（3.1.4）45 mL，振摇，超声提取10 min，放冷，加甲醇（3.1.4）定容至刻度，摇匀，用滤膜（0.22 m，有机相型）过滤，取续滤液，可根据实际浓度适当稀释至线性范围内，供液相色谱-质谱联用仪分析。5.1.3酒准确吸取1 mL，置蒸发皿中，水浴蒸至无醇味，用适量甲醇（3.1.4）溶解并转移至50 mL量瓶中，振摇，超声提取10 min，放冷，加甲醇（3.1.4）定容至刻度，摇匀，用滤膜（0.22 m，有机相型）过滤，取续滤液，可根据实际浓度适当稀释至线性范围内，供液相色谱-质谱联用仪分析。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱条件5.2.1.1 系统1（测定苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍、伏格列波糖、阿卡波糖）a) 色谱柱：酰胺基键合杂化颗粒色谱柱 (2.1100 mm， 3.5 m)，或性能相当者；b）流动相：A为含5 mmol/L的甲酸铵溶液（3.2.2），B为5 mmol/L甲酸铵乙腈溶液（3.2.3），梯度洗脱程序见表2；c）流速：300 L/min；d) 柱温：70；e) 进样量：1 L。表2 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相A/%流动相B/%05951.510903.510905.030708.030708.0159510.05955.2.1.2 系统2（测定维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、达格列净、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、卡格列净、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、曲格列酮、格列喹酮、莫格他唑、GW501516、环格列酮）a) 色谱柱：亲水三键键合相实心核颗粒色谱柱 (2.1100 mm， 2.7 m)，或性能相当者；b）流动相：A为含0.1%甲酸水溶液（3.2.1），B为乙腈（3.1.1），梯度洗脱程序见表3；c）流速：300L/min；d) 柱温：30；e) 进样量：1L。表3 梯度洗脱程序表梯度时间/min流动相A/%流动相B/%09555955222982729827.5955329555.2.2 质谱条件a) 离子源：电喷雾离子源（ESI源）。b) 检测方式：多反应监测（MRM）。c) 扫描模式：正离子模式或负离子模式。d）干燥气、雾化气、鞘气、碰撞气等均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附录A。5.3 定性测定按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准工作溶液中相应成分的相对离子丰度。当试样中检出与27种化合物中某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在2.5%之内），并且相对离子丰度允许偏差不超过表4规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。表4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对丰度（%）最大允许偏差（%）k50%2050%k20%2520%k10%30k10%505.4定量测定5.4.1标准曲线的制作将混合标准工作溶液A（3.4.5）分别按仪器参考条件（5.2.1.1和5.2.2）进行测定，将混合标准工作溶液B（3.4.6）分别按仪器参考条件（5.2.1.2和5.2.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4.2试样溶液的测定将试样溶液（5.1）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。6 空白试验除不加试样外，均按试样同法操作。7 结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：（1）式中：X 试样中各待测物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c 从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样溶液所代表的质量，单位为克（g）；K 稀释倍数。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8 检测方法的灵敏度、精密度、专属性8.1 灵敏度固体和液体取样量为1 g或1 mL，定容体积为50 mL时，伏格列波糖、阿卡波糖、达格列净、卡格列净、曲格列酮、环格列酮的定量限为12.5 mg/kg或12.5 mg/L；苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍、维达列汀、罗格列酮、西他列汀、吡格列酮、氯磺丙脲、达格列净、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、醋磺己脲、妥拉磺脲、瑞格列奈、卡格列净、格列齐特、格列波脲、格列本脲、那格列奈、格列美脲、曲格列酮、格列喹酮、莫格他唑、GW501516、环格列酮的定量限为0.25 mg/kg或0.25 mg/L。8.2精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8.3 专属性 空白试验应无干扰。附录A化合物相关信息