研 究 生 课 程 论 文(2014-2015 学年第一学期)蛋白质分离纯化技术的现状与发展研究生：刘玲玲提交日期： 2015/1/17 研究生签名：学 号 201420123151 学 院 轻工与食品学院课程编号 S0832050 课程名称 高级食品化学学位类别 硕士 任课教师 赵谋明、赵强忠、苏国万教师评语： 成绩评定： 分 任课教师签名： 年 月 日蛋白质分离纯化技术的现状与发展刘玲玲摘要：蛋白质在细胞中的含量极低，将其从复杂的体系中分离出来并保持一定的活性，难度较大，因此分离纯化蛋白质的方法备受生命科学领域关注。本文主要综述了蛋白质各种分离纯化技术，以及相关的应用现状，讨论各种方法的特点与应用局限，并展望蛋白质分离纯化的前景。关键字：蛋白质 提取 分离 纯化 应用Abstract：Protein has a very low level in the cells. It is very difficult to be separated from the complex system and keep its activity. So the methods of separation and purification are paid close attention to by the life science territory. Protein separation-and purification techniques were summarized. Discussed the technical characteristics and Application Limitation of methods, and the related application status, discuss the characteristics and limitations of the various methods of application and Prospect protein separation and purification .Keyword：protein; isolation; purification; application蛋白质的生物体的生命活动过程中，起着必不可少的作用，特别是一些具有生理活性的蛋白质，而这些具有一定特殊功能的蛋白质通过各方面的生物学技术以逐渐在医疗和食品方面等得到应用。但许多功能性蛋白质在细胞中的含量确实极低的，要把这些蛋白质从复杂的体系中提取出来也是相当有难度的，再加上蛋白质本身具有的特殊性质，如：（1）对温度、酸度、剪切力敏感，极易变性失活；（2）蛋白质产品在物料中含量低；（3）性质不稳定，易受料液中蛋白酶水解；（4）产品对蛋白质质量纯度要求高。因此，蛋白质的分离与纯化技术已成为当前生物工程的的热点问题。传统的蛋白质分离纯化方法主要有盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、萃取、离子交换法等，这些技术无一例外过程都比较繁琐、耗时、损耗原料、能耗高。随着生物科技的飞速发展，出现许多高效的分离技术和手段，如：高效液相色谱，毛细血管电泳，分子印迹法，大孔吸附树脂法，纳滤和超滤，联用技术等。文章针对近年来有关蛋白质的分离技术所取得的进展做如下综述。1 蛋白质的预处理在分离纯化蛋白质之前，需要将蛋白质从复杂的组织中分离释放出来，同时要保持蛋白质原有的结构性质与天然状态，仍然具有本身的活力。因此，蛋白质的分离要根据其本身的特性以及分离纯化蛋白质的原料的理化特征，选取合适的提取方式与溶剂，具有针对性的进行预处理。目前主要的预处理方式有水溶液提取法、有机溶剂提取法、酶法、超声波萃取法、双水相萃取法和反胶团萃取法。水溶液提取法一般用稀盐和缓冲体系的水溶液作为提取蛋白质的常用溶剂。一般而言，碱性蛋白利用偏酸性的提取液提取，酸性蛋白用偏碱性的提取液，提取温度一般为低温（4以下）操作，这视有效成分的性质而言。有机溶剂提取法是利用一些与脂质结合的比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质如溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，用有机溶剂如乙醇、丙酮和丁醇提取。酶法相对于传统的碱法提取具有时间短、反应条件温和、不产生有害物质等优点，近年来，酶在蛋白质分离纯化中的应用非常广泛。在一般条件下碱性蛋白或碱性酶、肽类在酸性环境下比碱性环境下稳定，反之亦然。因此，在利用酶对蛋白质进行预处理时，要选择合适的酶以及操作环境，已达到较好的提纯效果。超声波萃取法是利用超声波波动与能量双重属性，破碎细胞（空化作用）和强化作用（机械作用） ，使细胞中蛋白质成分更好的释放出来。Moultou 等 1在对大豆蛋白的提取试验中发现，超声波提取法的蛋白质提取率相对于水提法和碱法要提高 23%，且提取相同数量蛋白质所需要的的能量比传统分批提取节约 30%。双水相萃取法是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相，由于被分离的物在两相中分配不同，因而实现分离，龚丽芬 2等以聚乙二醇、硫酸钠双水相体系分离提取琼脂糖和胃蛋白酶，结果发现胃蛋白酶的回收率为 50%。反胶团萃取是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时，自发聚集而形成一种纳米尺寸的聚集体，将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的 3。程世贤 4用反胶团提取大豆中的蛋白质和豆油，大豆蛋白质的萃取率最高达到 96.9%，豆油的萃取率为 90.5%。2 蛋白质的分离纯化技术2.1 沉淀法 2.1.1 盐析沉淀法 盐析法是根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用，沿用至今的方法。具有成本低，操作简单，对蛋白质生物活性有稳定作用等优点。一般粗抽提物常用该法进行粗分。2.1.2 等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。李殿宝 5在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白质溶液的 pH 值调到 3-4，使目的蛋白在等电点沉淀出来。2.1.3 有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，另有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法，常用于蛋白质和酶的提纯中。2.2 层析法2.2.1 离子交换柱层析 离子交换层析（Ion exchange chromatography,IEO）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换是结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法,离子交换层析中，基质由带电荷的树脂或纤维素组成 6。一般情况下，粗胶粒的离子交换剂用在提纯的前面步骤中，高分率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中。2.2.2 疏水作用层析 多数疏水性氨基酸藏在蛋白质的内部，也有一些在表明,蛋白质表面的疏水性氨基酸残基数目与按分布决定了该蛋白的是否具有与疏水柱填料相结合从而利用它来进行分离的能力 7。高浓度盐的水溶液中蛋白在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白从柱上被洗脱，因此特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后含有目标产品的溶液直接加样到柱上，也适用 7mol/L 盐酸胍或 8mol/L 脲的大肠杆菌治疗但阿比提取液直接加样到柱上，在分离的同时也对其进行了复性。疏水岑溪具有较少使多肽变性的特点 8。2.2.3 亲和层析 利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异性识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱法。目前亲和层析技术已被广泛的应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。利用该法从粗提取液中经过一次简单的处理便可得到所需的高浓度活性物质 9。Reddy 等 10应用 Cibacron Blue 亲和层析的方法从心肌网状组织中提取了 Ca2+-腺苷三磷酸酶。2.2.4 羟基磷灰石柱层析 吸附剂羟基磷灰石可用于分离蛋白质和核酸。蛋白质中带负电荷基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合。而带正电基团与磷酸基相互作用，羟磷灰石对蛋白质的吸附容量比较大。因此，根据蛋白质分子与吸附剂羟磷灰石之间的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离的目的。2.2.5 凝胶层析 混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的间隙最先流出柱外，分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受到阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。作为一种快速简便的分离技术，由于设备简单操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用。2.2.6 置换层析 作为一种非线性的层析技术，与传统的洗脱层析技术相比有明显的优点，即高上样量、高产率。高分辨率、及被分离样品在分离过程中的浓缩效应，这一技术已经越来越引起人们的关注 11。研究表明，置换剂的相对分子质量越低，越容易与固定相结合，因此在分离相对分子质量较小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来 12。2.2.7 灌注层析 灌柱层析（ PC）是今年来新发现的一种层析技术，主要利用分子筛原理与高速流动的层析模式，其特点是含有双空结构，不仅含有大量的常规层析介质的微孔，而且还含有纵横交错贯穿介质的“大孔” ，流动相速度和孔径大小直接影响分离效果。目前，PC 技术代替传统层析技术为世界著名制药工业及科研机构创造了更多成功的机会，我国在利用 PC 分离生物活性多肽，筛选生物活性先导化合物方面起步较晚，仍有很多工作有待今后的研究，其发展前景十分广阔。2.2.8 金属离子亲和层析 金属离子亲和层析（IMAC）是利用金属离子的络合或形成的螯合物来吸附蛋白质的分离系统。目前已经发现的金属离子如锌和铜，能够很好的与半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基结合，然后通过 IMAC 将这些含有不同数量基团的蛋白质进行分离 13。2.2.9 免疫亲和层析 免疫亲和层析（IAFC）是以抗体中的一方作为配基，亲和吸附另一方的层析方法 14。与 IMAC 相比较，IAFC 的专一性强、亲和力好、效率高、容量大。对目标多肽具有保护作用，分离时不易发生非特异性吸附，适合于分离低微量的样品。目前利用抗体抗原模式分离纯化蛋白质的研究较多。邓文涛等 15利用亲和层析方法重组鲤鱼生长素（rcGH） 。冯小黎等 16采用合成的 -干扰素单克隆抗体高效液相亲和介质纯化由大肠埃希菌表达的基因重组人 -干扰素，纯化倍数达 79 倍，活化回收率为 94%。后来的研究发现这种亲和层析技术载体昂贵，机械强度低，配制困难，容易掺入杂志，所以有待今后改进。2.3 离心法2.3.1 速率区带离心 速率区带法是一次分离不同类型聚合物最有效的方法，是根据大小、性状的不同的颗粒在梯度液中沉降速度的不同建立起的分离方法 17。离心前预先在离心管中装入密度梯度（如蔗糖、氯化铯） ，被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与密度的福利相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的 18。如果离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳的分离时间，得到相当纯的细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题。2.3.2 差速离心法 差速离心是通过不断的增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度以及不停离心时间下多次离心的方法，差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。在离心的同时需要控制好离心的时间和离心力的大小。离心力过大或时间