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A n t i f u n g a lM e c h a n i s mo fP l a g i o c h i nE ,a nA n t i f u n g a l A c t i v eB i s ( b i b e n z y l s ) ,a g a i n s tC a n d i d aa l b i c a n s 作 专 导 合作导师 2 0 1 0 年5 月2 8 日 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名:黑盔题 日 期:墨塑墨:垄! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名:羔查塑导师签 山东大学博士学位论文 目录 中文摘要l 英文摘要4 符号说明8 第l 章前言9 1 1 临床真菌感染流行病学9 1 2 真菌耐药10 1 3 克服真菌耐药性的策略1 6 1 4 抗真菌剂及其作用机制18 1 5 真菌凋亡途径2 4 1 6 苔藓植物中的生物活性成分3 1 1 7 本课题研究内容及意义3 3 参考文献3 4 第2 章基因芯片技术分析羽苔素E 作用后白色念珠菌的差异基因表达谱4 1 2 1 实验材料4 l 2 2 实验方法4 3 2 3 实验结果4 6 2 4 讨论6 0 参考文献6 1 第3 章羽苔素E 通过诱导真菌细胞内活性氧累积导致细胞死亡6 4 3 1 实验材料6 4 3 2 实验方法6 6 3 3 实验结果7 0 3 4 讨论8 0 参考文献8 2 第4 章羽苔素E 通过激活m e t a c a s p a s e 诱导真菌凋亡8 6 4 1 实验材料8 7 4 2 实验方法9 0 4 3 实验结果9 5 山东大学博士学位论文 4 4 讨论1 0 4 参考文献。10 7 第5 章羽苔素E 抑制白色念珠菌细胞壁中几丁质的合成1 1 2 5 1 实验材料。113 5 2 实验方法。11 6 5 3 实验结果。11 9 5 4 讨论12 4 参考文献12 6 第6 章苔藓植物中羽苔素E 的化学生态学意义研究1 2 9 6 1 实验材料12 9 6 2 实验方法131 6 3 实验结果1 3 4 6 4 讨论1 4 1 参考文献1 4 2 1 改谢1 4 5 攻读学位期间发表的学术论文目录1 4 6 山东大学博士学位论文 双联苄类化合物羽苔素E 的抗真菌机制 专业:药物化学 研究生:吴秀祯 导师:娄红祥教授 中文摘要 近年来,随着广谱抗生素的大量应用、艾滋的蔓延、癌症化疗和器官移植所 引起的免疫抑制的增加、以及器官插管术的广泛开展,临床真菌感染的发病率和 死亡率呈逐年上升趋势。特别是持续性免疫缺陷患者,其真菌感染率更高。真菌 感染,特别是深部真菌感染难以治疗。临床常用抗真菌药物主要是唑类药物和两 性霉素B ,这些抗真菌药物均对人体有不同程度的毒副作用;且随着抗真菌药物 的广泛应用,临床上出现越来越严重的真菌耐药现象。因此,临床上迫切需要寻 找新的抗真菌药物来治疗真菌感染。 苔藓植物是植物界中仅次于被子植物的高等植物,全世界约有2 3 0 0 0 种。其 中藓( m o s s e s ) 1 4 0 0 0 余种,苔( 1 i v e r w o r t s ) 6 0 0 0 余种,角苔( h o m w o r t s ) 3 0 0 余种。 其在系统发育学上位于藻类和蕨类植物之间。在中国和印度,苔藓植物作为一种 传统药物,被用来治疗心血管疾病、扁桃体炎、支气管炎、中耳炎、膀胱炎、皮 肤病以及烧伤等。近年来植物学家从苔藓植物中分离获得了大量结构新颖且活性 显著的萜类化合物和芳香族化合物,其中许多可作为新药研究的优良先导化合 物。对苔类植物活性成分的研究表明苔类植物是生物活性天然产物的重要来源。 地钱属植物为叶状体苔类。从地钱中分离得到的大环双联苄具有广泛的生物 学活性,如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗细菌和细胞毒活性等,因此它们受到越 来越多的关注。羽苔素E 是从地钱( M a r c h a n t i a p o l y m o r p h aL ( M a r c h a n t i a c e a e ) ) 中分离得到的一种双联苄类化合物。药理学活性实验表明2 1 2I _ t g r n l 羽苔素E 可以逆转阿霉素诱导的K 5 6 2 A 0 2 细胞的多药耐药性,而对正常细胞仅表现微弱 毒性。进一步研究发现,羽苔素E 有抗白色念珠菌的作用,并通过提高耐药真菌 细胞内氟康唑药物浓度而逆转真菌耐药。提示羽苔素E 具有非常好的药物开发价 值。但是羽苔素E 的抗真菌作用机制尚未阐明。因此,本课题的目的就是通过一 系列实验阐明羽苔素E 的抗真菌机制。 山东大学博士学位论文 基因表达谱分析技术为羽苔素E 的抗真菌机制研究提供了全新和有效的研究 手段。利用白色念珠菌基因组芯片绘制了羽苔素E 作用后白色念珠菌的基因表达 谱,分析比较相互问的不同,在全基因范围内寻找受羽苔素E 影响的相关基因。 基因芯片结果显示多个被羽苔素E 上调或下调的基因与线粒体功能有关。而线粒 体是细胞内的重要细胞器,在氧代谢、A T P 产生和钙平衡中发挥重要作用。提示 线粒体是羽苔素E 的潜在抗真菌靶点。因此,实验进一步测定了羽苔素E 对白色 念珠菌线粒体功能的影响。在实验中,采用罗丹明染色法测定羽苔素E 作用后白 色念珠菌的线粒体膜电势,高效液相色谱法测定白色念珠菌线粒体内A T P 含量, 分光光度法测定线粒体F o F l - A T P a s e 和脱氢酶活性,荧光法测定线粒体内活性氧 含量。实验结果显示羽苔素E 导致白色念珠菌线粒体膜电势超极化和线粒体内 A T P 耗竭。线粒体F o F l - A T P a s e 水解A T P 的活性被显著提高,使得线粒体内A T P 被过度水解,导致线粒体内A T P 耗竭。在水解A T P 的同时,F o F l - A T P a s e 将质子由 线粒体胞浆泵入线粒体膜间隙,进而导致线粒体膜电势超极化。线粒体脱氢酶的 活性被显著抑制,引起真菌细胞内能量代谢异常,导豸t A T P 合成减少。羽苔素E 所致线粒体功能的异常导致线粒体内活性氧累积。抗氧化剂半胱氨酸不但可以抑 制羽苔素E 诱导的线粒体内活性氧累积,而且可以抑制羽苔素E 的抗真菌活性。 提示活性氧是羽苔素E 发挥抗真菌作用的关键介质。 活性氧是真菌凋亡的关键调节因子。因此,实验进一步研究羽苔素E 诱导的 白色念珠菌线粒体活性氧累积是否导致真菌凋亡。实验采用流式细胞术检测羽苔 素E 作用后细胞周期的变化,超薄透射电镜观察真菌超微结构的改变,D A P I 染色 法观察细胞核形态变化,F I T C a n n e x i nV 染色法观察白色念珠菌磷脂酰丝氨酸的 外翻,R T P C R 法测定羽苔素E 对白色念珠菌C D C 2 8 、C L B 2 和C L B 4 表达水平的影 响,F I T C V A D F M K 荧光染色法测定羽苔素E 作用后白色念珠菌m e t a c a s p a s e 活 性,分光光度法测定线粒体内细胞色素C 含量。实验结果显示羽苔素E 导致白色 念珠菌出现典型的凋亡特征,包括细胞周期阻滞在G 2 M 期、染色体凝集、细胞 核裂解和磷脂酰丝氨酸的外翻。提示羽苔素E 导致了白色念珠菌细胞凋亡。 C D C 2 8 、C L B 2 和C L B 4 的表达被羽苔素E 下调,导致白色念珠菌细胞周期阻滞。 羽苔素E 促进白色念珠菌线粒体内细胞色素C 释放,并激活 “ m e t a c a s p a s e 。抗氧 化剂半胱氨酸抑制羽苔素E 导致的细胞核裂解、磷脂酰丝氨酸的外翻以及 2 山东大学博士学位论文 m e t a c a S p 嬲e 的活化,提示活性氧是羽苔素E 所致细胞凋亡的重要介质。实验结果 表明羽苔素E 通过引起白色念珠菌线粒体活性氧累积,进而激活m e t a c a s p 嬲e 诱导 真菌凋亡,从而发挥其抗真菌作用。 细胞壁是真菌细胞的重要结构,完整的细胞壁为刚性结构,作为物理化学屏 障保护细胞及其内的酶类,并控制细胞内膨胀压力以维持菌体的完整性。细胞壁 还参与调节营养物质的吸收和代谢产物的分泌,在维持真菌的生长和正常的生理 功能中起到重要作用。几丁质是真菌细胞壁的主要成分之一。几丁质合成酶催化 N 乙酰氨基葡萄糖在细胞膜上聚合成几丁质,在真菌细胞的分裂和成熟中发挥重 要作用。在前期实验中,透射电镜结果显示羽苔素E 处理后的白色念珠菌细胞壁 出现明显损伤,并且细胞分裂受阻
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