,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,第五章 基因的重组与转移,一、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,第一节 DNA片段的体外连接,1. 两段DNA的连接,依靠粘性末端,2. DNA片断与载体的连接,依靠粘性末端,ligase,nick,二、齐平末端（blunt end）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1. 直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。,（1）同聚加尾 法,2. 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接, linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：, linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylinker:,优点：,（3）DNA接头 (adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。, adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。, adapter的作用,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG- GGCC-,-CCGG -GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG- GGCC-,CCGG GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P,P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！,5GATCCCGG-OH HO-GGCC5,5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5GATCCCGG- HO-GGCC,CCGG-OH -GGCCCTAG5,5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,三、PCR产物的连接,1. 在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAGCCGG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,CGATCGGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAG,PCR产物,-5,3-,G,C,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2. 与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,决不能进行非粘性末端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2. DNA插入的方向正确,（1）用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重组,但移码突变！,4. 防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,1. 载体自身环化连接（能存活）,2. 载体之间互相连接（能存活）,3. 插入片段互相连接（不能存活）,4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）,五、载体和外源DNA插入片段的连接结果,5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）,17,1. 目的,增加受体菌细胞膜的通透性。,第二节 重组体导入细菌细胞,一、感受态大肠杆菌的制备,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,2. 菌种,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,3. 制备原理,4. 制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（2）转染（transfection),大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。,1. 外源DNA导入细菌的几种方法,（3）转导（transduction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,每gDNA转化成功的细菌克隆数。,3. 转化方法,2. 转化率,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,（1）热休克法（heat shock）,转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,10ng载体DNA,100L感受态菌,On ice混合，静置10分钟,42C 1分钟,加入1mL LB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热休克法,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成 50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,（2）电转化法,4. 平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,环形重组质粒 质粒自我连接,线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。,环形质粒数,（1）重组质粒,5. 影响转化率的因素,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（2）感受态细胞 （competent cells),把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,6. 体外包装的噬菌体的转导,（1）体外包装（in vitro packaging）,（2）转导（transduction）,通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。,cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。,（3）cI857基因突变的噬菌体,但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。,cI857,其它基因,溶源状态（DNA不转录、不翻译）,DNA,阻遏 蛋白,阻遏 蛋白,4445,DNA转录、翻译合成外壳蛋白,32,噬菌体1,外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。,在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。,（4） 互补型噬菌体,外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。,噬菌体2,(5) 体外包装过程,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。,（6） 转导,转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。,第三节 外源基因导入真核细胞,一、导入酵母细胞,1. 菌株选择,如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his31,（1）利用原生质球进行转化,2. 酵母的转化方法,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、 PEG,插入外源基因 的酵母载体,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,酵母,0.1mol/L LiCl处理,插入外源基因的酵母