T h eR e s e a r c ho nE x t r a c t i o nP r o t e i na n dB i o l o g i c a lA c t i V i 够o f H y d r o l y s a t e D e r i v e df r o mC a m e l l i aO l e i f e r aA b e lS e e dM e a l B y Z H A 0Y a n h u a At h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no f t h e R e q u i r e m e n t sf o r t h ed e g r e eo f M a s t e ro fE n g i n e e r i n g P r o c e s s i n ga n dS t o r a g eo f A g r i c u l t u r e P r o d u c t sE n g i n e e r i n g C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t yo fF o r e s t r ya n dT e c h n o l o g y 4 9 8S h a o s h a nS o u t hR o a d ，T i a n x i nD i s t r i c t C h a n g s h aH u n a n 410 0 0 4 ，P R C H I N A S u p e r v i s o r A s s o c i a t eP r o f e s s o rG O N GJ i j u n M a y , 2 0 1 2 中南林业科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为 获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材 料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 艺- r 吖 作者签名：；隧生平 ， 0 D 0 年j 月弓口日 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文 的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林 业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 ， 本学位论文属于： 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囹。 ( 请您在以上相应方框打“4 “ ) 作者签名爽建牟导师签名：墨复季 口，年J 月弓。日卅7 年j 月如日 摘要 油茶( C a m e l l i ao l e i f e r a ) 属于茶科山茶属，为常绿小乔木，是我国主要的油料作物 之一。据统计，我国每年产油茶籽1 0 0 多万吨，油茶籽副产品一油茶粕年平均产量约 为6 8 3 9 万吨，但是油茶籽粕的有效利用率很低，造成了很大的浪费。油茶籽中蛋白 质的含量在1 5 2 0 ，可以作为新型的植物蛋白资源，近几年通过研究报道，油茶 粕蛋白多肽具有降血压，免疫，抗氧化等功能，从而成为医学和功能性食品学的热门 研究领域。 本论文以油茶籽为原材料提取蛋白，研究了将脱脂后的油茶粕经纤维素酶预处理 后再提取油茶蛋白的工艺路线，优化得到最佳的酶预处理条件为：酶与底物比为 2 6 7 ，水解温度为4 3 6 7 0 C ，水解时间为1 0 4 1 h ，再用后续处理条件水解后油茶粕 蛋白质的提取率为7 0 3 6 ，与未使用纤维素酶预处理的相比( 蛋白提取率6 4 9 7 ) 有明显提高。 以油茶粕蛋白为原料以p H 值( x 1 ) 、水解时间( X 2 ，h ) 、水解温度( X 3 ，o C ) 和酶与底物比( X 。，) 作为参试因子，以油茶粕蛋白水解液中A C E 抑制活性为响 应值，利用D e s i g n E x p e r t 统计分析软件得到了A C E I 随p H 值、水解时间、水解温度 和酶与底物比变化的标准回归模型。优化的水解条件为：最适p H 值为8 1 ，最佳酶 与底物比为1 5 7 ，最佳的水解温度为5 0 5o C 和最佳的水解时间为6 6 6h 。在此最 佳条件下，油茶粕多肽的模型预测A C E I 值为8 6 1 7 通过对S H R 灌胃由碱性蛋白酶水解制得的油茶粕多肽( M W 0 0 5 ) 。说明响应面分析法优化 所得的参数是可靠的。 2 3 本章小结 本章主要对油茶粕的主要成分进行的测定，同时对提取油茶粕蛋白的纤维素酶预 处理工艺进行了研究，总结如下： ( 1 ) 经过脱脂后的油茶粕脂肪的含量很低，有利于后续工艺的进行，同时粗蛋 白和多糖含量很高，具有很高的开发利用价值。 ( 2 ) 通过中心组合实验设计和运用D e s i g n E x p e r t 7 1 T r i a l 的数据处理得到的各因 素影响蛋白质提取率的回归方程能较好的预测试验结果。优化的酶预处理条件为：酶 与底物比为2 6 7 ( X l = 0 6 7 2 ) ，水解温度为4 3 6 7o C ( X 2 - - - 0 0 8 9 ) ，水解时间为1 0 4 l h ( X a = 0 4 7 1 ) ，再用后续处理条件水解【8 2 】：料液比l ：2 5 ，p H 值1 0 4 ，浸提时间为2 4 2 h ，浸提温度为4 9 2o C ，此时油茶粕蛋白质的提取率为7 0 3 6 ，与未使用纤维素酶 预处理的相比( 蛋白提取率6 4 9 7 ) 提高了5 3 9 差异显著。 ( 3 ) 目前提取油茶粕蛋白质的方法主要是单一的碱溶酸沉法，本论文主要研究 了将脱脂后的油茶粕经纤维素酶预处理后再提取的工艺路线，该方法在其他文献中未 出现相同报道，因此这种方法是一种新的提取油茶蛋白工艺。 1 9 中南林业科技大学硕士学位论文 油茶粕蛋白提取及其水解物生物活性研究 中南林业科技大学硕士学位论文 油茶粕蛋白提取及其水解物生物活性研究 3 油茶粕A C E 抑制肽制备条件优化及其体内降血压活性研究 我国油茶资源丰富，据统计，目前年产油茶籽1 0 0 多万吨，油茶籽副产品一油茶 粕年平均产量约为6 8 3 9 万吨【4 J ，是世界上油茶籽产量最高、分布最广、品种最多的 国家。油茶籽粕是油茶籽榨油后的固体残渣，经压榨提油后的油茶籽粕中仍含1 0 - 2 0 的蛋白质和一定量皂素、多糖、多酚类物质【8 3 1 。但是大多数的油茶粕只是作为 有机肥料来使用，造成资源的极大浪费。近几年来油茶粕中富含的蛋白质资源日益引 起关注。李远志晔】等对油茶粕蛋白提取进行了研究，并研制出高营养价值的茶籽蛋白 奶，严子军【8 5 】从油茶粕中提取蛋白并将其应用到油茶粕蛋白奶、洗发水添加剂等产品 的开发中，也有报道表明油茶粕蛋白制备出油茶粕多肽具有清除自由基的活性哺引。 食用蛋白在蛋白酶的作用下，能水解生成不被三氯乙酸所沉淀的多肽类物质【s7 1 ， 多肽除了具有易被人体消化吸收的特性外，还具有多种对人体有益的生理功能，如很 强的抗氧化、免疫调节、降血压、降低胆固醇、治疗骨质疏松症等保健功能【s 舯引。酶 法水解蛋白质是目前生产多肽的主要方法，多种蛋白酶相继被用于水解各种蛋白质原 料，从而制备高价值的功能性多肽。 目前，高血压已成为威胁人类健康的主要疾病之一，因其与脑卒中、心力衰竭和 冠心病等一系列心脑血管疾病的高度关联而引其人们的高度关注。无论是在发达国家 还是在像中国等新型工业国家，随着人们生活水平的大幅改善和提高，高血压疾病的 发生率也在大幅度提高。资料表明，世界各国的平均发病率为l O “ - - 2 0 ，全球每年 因高血压死亡的人数达1 2 0 0 万【9 3 】，而在我国高血压患者已超过1 6 亿【9 4 1 。对高血压 疾病控制的研究是医学和功能性食品学的热门研究领域，而对血管紧张素转化酶的研 究是其中重要的方向之一。 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i nI - c o n v e r t i n ge n z y m e ，A C E ) 为含锌羧肽酶，其 广泛分布于哺乳动物组织中，并对血压调节起着关键作用。A C E 对血压的调控表现 为，一方面通过促进不具有催化活性的血管紧张素I 转化为具有促进血管收缩作用的 血管紧张素I I ，另一方面通过降解具有舒张血管紧张作用的舒缓肌肽使其失活【9 5 】。来 源于食物蛋白的A C E 抑制肽可抑制A C E 的活性，从而起到降血压的作用。采用纯天 然、无任何毒副作用的A C E 抑制肽来控制高血压患者的血压，可最大限度地克服西 药类降血压药物给患者带来的毒副作用，因而越来越受到现代社会的广泛重视。 目前很少有关于油茶粕多肽A C E 抑制活性及降血压效应的研究报道。本研究主 要以油茶籽为原料，通过蛋白酶的筛选后以水解p H 、水解时间、水解温度和碱性蛋 白酶的用量这四个因素作为参试因子，以油茶粕蛋白水解液中A C E 抑制活性为响应 值优化水解条件，以期探明制备油茶粕A C E 抑制肽最佳的蛋白酶及其最佳的水解条 件、油茶粕多肽体外与体内的A C E 抑制活性以及对原发性高血压大g ( S H R s ) 的降压 2 1 中南林业科技大学硕士学位论文油茶粕蛋白提取及其水解物生物活性研究 活性。 3 1 材料与方法 3 1 1 材料与试剂 材料：油茶籽( 购自湖南株洲) ；油茶粕( 实验室自制) 。 药品及试剂：碱性蛋白酶A l c a l a s e ( 活力：1 2 0U r a g ) 、胃蛋白酶P e p s i n ( 活力：1 2 0 U m g ) 、中性蛋白酶N e u t r a s e ( 活力：1 2 0U m g ) 、木瓜蛋白酶P a p a i n ( 活力：1 0 0U m g ) 、 胰蛋白酶一T r y p s i n ( 活力：1 0 0U r a g ) 和风味蛋白酶一F l a v o r z y m e ( 活力：1 0 0U m g ) - 中 国化学试剂公司；A C E ( A 兔肺提取) 和H i p p u r y l - L - h i s t i d y l L l e u c i n e ( H H L ) - S i g m a 公 司( 美国) ；氢氧化钠、三氯乙酸等均为分析纯试剂。 3 1 2 主要仪器与设备 T L - 1 8 M 型台式高速冷冻离心机： T U 1 9 0 1 分光光度计： L - 8 9 0 0 氨基酸分析仪： H P M 1 0 0 板框式超滤器： 微量凯氏定氮仪： B P 6 型动物无创血压测定仪： A R l l 4 0 型电子分析天平： 3 1 3 试验方法 上海市安亭科学仪器厂； P u r k i n j eG e n e r a l ( q b 国) ； H i t a c h i ( 德国) ； 中科院上海原子能研究所； 湖北恒康化玻仪器公司； 成都泰盟科技有限公司； 奥豪斯国际贸易有限公司 3 1 3 1 水解油茶粕蛋白酶的筛选 由于不同的蛋白酶对底物的专一性不同，故通过试验比较来确定油茶粕蛋白最适 水解酶。本试验有代表性地选择了以上几种蛋白酶对油茶粕蛋白进行水解。表3 1 总 结了它们各自的最适的条件范围【9 6 母9 1 。 为了筛选出适宜生产A C E 抑制肽的蛋白酶，用