高通量测序技术在肿瘤基因检测中的应用 易鑫 精准检测是精准医学的基础 样本要求 杂交捕获还是PCR扩增 测序平台的选择 高通量测序检测突变类型 常用生物信息分析软件与数据库 CONTENTS 目录 高通量检测灵敏度与测序深度的关系 2 ctDNA测序与低频突变检测 3 肿瘤高通量测序技术流程简介 1 肿瘤高通量测序的临床应用 4 肿瘤病理组织/手 术标本/血浆/体 液等 个体配对正常对照 （白细胞、癌旁） DNA 打断/无需打断 不打断 目标区域捕获 （液相杂交） PCR扩增 文库制备 Illunima测序 Proton测序 原始下机数据 生物信息分析 MuTect GATKSomatic Indel Contra 肿瘤突变 鉴别真正的体细胞突变 正常多态性 肿瘤突变注释 遗传解读、用药选择 高通量测序肿瘤基因检测流程介绍 肿瘤高通量测序的样本 3 1 2 4 样本类型 肿瘤组织 血浆（ctDNA） 胸腹水 脑脊液 尿液等 DNA量：1030ng 不同样本类型、 检测灵敏度对样 本起始量要求不 同 对照样本 白细胞优于癌旁 组织 纯度问题 对检测结果影响 很大，是重要的 质控点 组织：肿瘤组织 70%为宜 血浆：避免白细胞基 因组的降解稀释 （直接影响检测灵敏 度和准确性） 病 理 切 片 手 术 标 本 穿 刺 标 本 富集技术的选择 扩增子 or 杂交捕获 覆盖度（coverage): 测序数据覆盖区域/探针or引物设计区域 特异性（specificity): 目标区域测序数据/总数据 均一度（uniformity): 目标区域碱基覆盖度的波动情况 重复性 (repeatability)：重复实验的波动情况 评价目标区域富集技术的关键点 方法方法 基于杂交捕获基于杂交捕获 基于基于扩增子扩增子 代表品牌代表品牌 SureSelect (Agilent) SeqCap (Roche) HaloPlex (Agilent) Ampliseq （Thermo) Truseq (Illumina) 富集时间富集时间 长 长 短 短 短 流程复杂度流程复杂度 高 高 低 低 低 捕获捕获区域区域 全外显子 全外显子 全外显子 全外显子 0.5M 模板量模板量 50ng (QXT) 100ng 100ng 50ng 50ng 特异性特异性 低 低 高 高 高 覆盖度覆盖度 好 好 好 好 好 均一度均一度 高 高 低 低 低 SNV（点突变（点突变） CNV （拷贝数变异）（拷贝数变异） 较差 较差 较差 SV（融合基因）（融合基因） 其它方面比较： 扩增子引物结合区域突变位点难以检测 PCR引物区域会测序数据的浪费 扩增子覆盖度不均一会导致低覆盖区域Calling准确性的下降 不同引物结合效率可能存在较大差异 PCR 不同探针结合效率差异不大 拷贝数变异（CNV）检测精度的比较 打 断 捕 获 CNV检测精度： 杂交捕获显著优于扩增子建库 Illumina Thermo 比较 准确性 SNV * * 相近 InDel * * Thermo对于连续相同碱基的读取错误率略高 CNV * * 相近 SV * * 相近 易用性 * * 相近 读长 * * 相近 通量 * * 各种通量机型可灵活选择 时间 * * Thermo在测序时间上具有一定优势 成本 * * 相近 应用 * * Thermo 乳液PCR技术对插入片段长度存在一定限制 Thermo无法双端测序，存在一定应用限制 SNV精度检测，两个平台检测精度相当 测序平台的选择 肿瘤体细胞突变SNV数据分析原理 突变 T（肿瘤） N（对照） 突变类型 GT 50% 0% 体细胞突变 50% 50% 生殖细胞突变 Science Translational Medicine 15 Apr 2015: Vol. 7, Issue 283 拷贝数变异(CNV)检测的原理 影响CNV检测的因素： 实验的重复性 不同类型样本基线的建立 CNV本身的大小 融合基因检测示意图 常用生物信息软件与数据库 数据分析软件： BWAGATK Suite for Germline Variants MuTect /GATKSomatic Indel /Contra for Somatic Variants 公共数据库： 肿瘤突变相关数据库： 临床用药信息数据库： 高通量测序的检测灵敏度 Sanger测序：10-15% ARMS PCR 检测：1% ddPCR检测：0.1% 高通量测序：？ 高通量测序检测灵敏度与测序深度的关系 5条Reads确定 一个可信突变 50% 10% 1% 0.1% 5/50%=10X 5/10%=50X 5/1%=500X 5/0.1%=5000X 测序深度决定检测 灵敏度 肿瘤 样本 1%的肿瘤含有该突变 （肿瘤的纯度、取样方式 影响非常大） 50%的数据利用率 最少5条reads确定一个突变 Y=5/0.5/0.01=1000X 成簇错误 合成错误 成像错误 上 机 测 序 PCR扩增错误 文 库 制 备 测序数据错误产生的原因 下机数据的背景错误在0.1%1%之间 0.1%1%的背景错误使高通量测序对0.1%以下的突变 检测面临挑战 液体活检液体活检-ctDNA检测检测 乳腺癌甲基化 胰腺癌KRAS 乳腺癌TP53 结直肠癌KRAS 肝癌/卵巢癌TP53 肺癌KRAS 黑色素瘤BRAF 1948年首次描述了游离核酸存在于人的血液中； 1994年癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异； 液体活检，ctDNA可反映癌症演化过程的动态信息； ctDNA由于其巨大的应用价值，被称为下一代癌症指标。 *Nature.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients.2011. ctDNA的高通量检测 ctDNA在血浆中的比例： 不同肿瘤，不同TNM分期ctDNA差别很大， 低至0.01%，检测技术难度很大。 方法 灵敏度 优势 缺陷 ARMS-PCR 1% 操作简单 速度较快 探针需要验证 受限于模板量，对于低频突变只能做 单个或几个位点的检测 （多重引物） Clamping PCR 0.1-1% Digital-PCR 0.1% BEAMing 1% Sequenom UltraSEEKTM 0.5% 高灵敏度检测：位点检测 or 高通量检测 ctDNA检测： 5ml全血 2ml血浆 3050ng cfDNA（健康人） 1020ng原始测序模板 30006000个基因组 （50%制备损失率） （3pg/genome） 对于0.1%频率突变，高通量测序可实现多基因多突变的一次性采集 低频纠错检测技术的开发 新的实验与数据分析方法可将测序背景错 误下降至0.0001%0.001%。 高通量测序对0.01%0.1%的突变检测变成 可能。 Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Sep 4;109(36):14508-13 低频纠错检测技术 可实现0.010.1%突变 比例的高通量精准检测 肿瘤精准用药单基因到多基因 NCI-MATCH打响精准医疗第一枪 基因检测 肺癌患者 外周血 组织 肺癌患者 肝癌患者 胃癌患者 外周血 组织 基因检测 异癌同治 （篮子试验） 同癌异治 （伞试验） 药物 靶点 估算的突变频率 Crizotinib ALK重排 4% Crizotinib ROS1 易位 5% Dabrafenib和 Trametinib BRAF V600E or V600K突变 7% Trametinib BRAF Fusions/ Non-V600E/Non-V600K BRAF 突变 2.80% Afatinib EGFR 1-4% Afatinib HER2 2-5% AZD9291 EGFR T790M 突变 and 稀有的 EGFR突变 1-2% Ado-trastuzumab emtansine HER2扩增 5% VS6063 NF2缺失 2% Sunitinib cKIT突变 4% a、所有实体肿瘤和淋巴瘤患者，不区分癌症类型； b、列表显示2015年6月入组基因与药物，不停在增加； c、目前基因检测范围包含200-300个药靶基因 NCI-MATCH基因与药物 ctDNA作为预后复发监测的指标 Digital PCR方法 断点检测方法 基于ctDNA的复发监测与疗效评估 ScienceTranslationalMedicine. 26 August 2015 Vol 7 Issue 302 ctDNA在结直肠癌患者复发监测的应用