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兰州大学 硕士学位论文 秃疮花提取物对红细胞氧化性溶血的抑制作用及其抗氧化机理 的探讨 姓名:赵祁 申请学位级别:硕士 专业:生物学、生物物理学 指导教师:王勤 20030501 摘要 目的:探讨秃疮花提取物( D L F ) 对鼠红细胞氧化性溶血的影响及其机理。方 法:以H 2 0 :诱导体外鼠红细胞发生氧化性溶血,以乙酰苯肼( A P H ) 引发小鼠 体内溶血性贫血,观察不同剂量D L F 对鼠红细胞溶血率,细胞形态,小鼠体内 的红细胞、白细胞数量,血红蛋白含量,血浆M D A 含量,红细胞中活性氧 ( R O S ) 生成量,红细胞内各种抗氧化酶活性,血浆总抗氧化力,以及红细胞 C R l 数量的改变来评价细胞受损的程度,并对其作用机理进行分析。结果:体 外D L F 对H 2 0 :诱导的鼠红细胞溶血的抑制率可达7 8 ( P ,壤培C E L L D Y N l 4 0 0 E X 全秘动盘球计数仅( 美重穗培公司 , 7 2 2 栅栏式分光光度计( 上海第三分析仪器厂) ,B H - 2 型捆差显撒镜 ( O l y m p u s ) ,3 5 5 0 鳌酶联检测仪( B I o - R 纳公司) 。 2 方法 2 1 体外实验。D L F 对H 舰诱导的鼠红细胞氧化性溶血的影响 2 + i 1 毅健康小鼠眼眶赧( 2 0 U m 1 4 肝素钠抗凝) ,用0 9 N a C l 溶液洗涤 3 次,制成0 5 的红细胞懋液,加入H 舷( H 。如终浓度为l O O m m o l L ) ,器分 8 剐加入0 2 m 浓度依次为1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 r a g m l ”的D 1 。F 溶 波,3 7 4 C 辉枣,依6 0 ,1 2 0 ,1 8 0 ,2 4 0 r a i n 分鲢取出,等量生残盐水稀释, 2 5 0 0 r m i n 。离心l O m i n ,取上清于4 1 5 n m 处测定A 值。将对照缎的A 值定义 为1 0 0 滚斑,诗冀溶盘趱菠。实验重复三次。“。 2 1 2 扫描电镜观察红细胞形态”,红细胞处理同上,3 7 。C 孵育6 0 m i n 后 鞭出,雳2 潞茂= 醛固定3 0 r a i n ,瘸P B S 漂洗三次,每浚5 m i n ,薅用0 1 锇 酸固定1 0m i n ,同样用P B S 漂洗。继以l O 、2 0 、3 5 、5 0 、7 0 、8 3 、 l O O 叔丁蘸梯度脱水,每级1 5 m i n ,C O 。临界点干燥和磺镀金属膜,用扫描电 镜在2 0K V 下观察并照相。 2 2 体内实验,D L F 对乙酰苯肼引发的小鼠溶血性贫血的影响 2 2 。l 实验动物的处壤及溶盘热焚盎动物模型瓣建立8 。”。 选用健康小鼠5 6 只,随机分为七组,每组8 只。分组如下,正常对照 缀( 0 。9 x a C l 溶滚l O m l k g 。d 。) ;模溪对照缀( 0 9 N a C l 溶液 l O m l k g 。d 1 ) ;为D L F 防护组,剂爨依次为1 9 k g d 、 1 + 5 9 - k g d 、2 9 k g 。d 、3 9 k g d 、4 9 k g - d 。各缀均于每同上 午定时进行腹腔注射( i p ) ,连续注射l O d ,除正常对照组外,其余各组皆于绘 药第一、第四、第七天下午i pA P I t 生理舷水溶液,首次剂量2 0 0 m g k g 一,后 联次剂量减半,建立溶壶悭贫盘动物模型。 2 2 2D L F 对小鼠体内红细胞、臼细胞数目和血红蛋白含量的影响嘲 对镶撼2 。2 。l 处理遘豹各缝,l 、藏羧莛取盘( 3 0 笺E D T A 二舞蕊凝) ,盘球诗 数仪下测定红细胞、白细胞数目和庇红蛋臼含量。实验重复三次。 2 。2 3D L F 对夺虢红缨藏静形态学影嫡 对依据2 2 1 处理避的各缎小鼠眼眶取血( 2 0 U m l 。肝索钠抗凝) , 0 9 N a c l 溶液洗搽3 次,制成1 红细胞懋液,p H 7 4 ,相夔显微镜下观察、照 相。实验薰复三次 9 2 2 。4D L F 对,l 、鬣盘浆褥二醛含囊豹影响。“”3 小鼠处理取m 同2 2 3 ,取做浆0 2 m l ,依次加入8 I S D S 溶液0 2 m l , 2 0 醋酸缓冲液( p H 3 5 ) 1 5 m l ,I T B A 溶液1 5 m l ,蒸馏水l m l ,充分混匀, 誉于8 0 。c 9 5 。C 下水浴4 0 至6 0 m in ,冷却,3 0 0 0 r m i n 。离心1 5 m i n ,取上清 液在5 3 2 n m 处测定A 值。实验重簸三次。 2 ,2 5D L F 对小鼠红缨腿武活性裁生成麓的影嗡 小鼠处理取珈同2 2 3 ,洗涤后取致细胞依攀建平法“2 3 破红细胞,制成溶 _ 敷滚,势菝试裁众方法遴行梭测,铡定劳诗冀夺鬣盔绸藏内活纛氧生战嚣。 实验重复三次。 2 2 6D L F 对小鬣红缁稳蠢菝氧纯酶活住酶影嫡融“删 小鼠处理取m 同2 2 3 。洗涤后取红细胞依试剂盒方法进行梭测,矜剐测 定鬣红细簸内S O D 活性,C A T 活性,G S H P x 活性,G R 活性,G - 6 - P D 活性。实 验重复三次。 2 2 7D L F 对小鼠血浆总抗氧化力的影响 小鼠处理取血霹2 。2 。3 ,取擞浆锿试剂鑫方法送毒亍捡溅,溅定著诗算小氯 血浆总抗氯化力。实验重复三次。 2 2 。8D L F 霹小鬣程缨魏C R l ( e 南受俸) 数塞豹影豌”嘲 小鼠处理取觑同2 2 3 ,分离红细胞,用p H 7 4 ,0 0 t m o l LP B S 洗涤两 次,取溢积红缨稳1 0 1 t l ,翱5 m lp n 7 4 ,0 5 m o l LT r i s - H C l 缓冲液,宣温 2 小时,使红细胞溶解,离心后用T r i s H C l 缓冲波洗沉积的红细胞膜一次。 将O 1 9 LC o n A l 0 0 1 l l 加入反应板孔中。3 7 。C2 0 m i n ;按常法洗三次,加入 l :1 0 0 稀释的待检缎缨胞膜1 0 0 9 l ,3 7 4 C 过夜;期O 。0 5 戊二醛1 0 0 塾I ,3 7 C 3 0 m i r a 洗后用小牛血清封闭,3 7 。Cl h 洗后加豚鼠血清( 1 :6 0 ) 1 0 0 1 1 1 ,3 7 。C l h ;洗爱鸯耩H R P 捷C 3 1 0 0 转1 ,3 7 。el h :浚嚣趣j 蓑物溶滚( T M B 一氆0 2 ) 显魏。 终止反应后于酶联检测仪4 9 0 n m 测吸光度( A ) 值。取复孔值。将对照组的A 值定义为1 0 0 ,得出红细胞C R I 数量指标。实验重复三次。 2 2 9 数据处理 结果以i s 表示,两组均数比较采用t 检验。体外实验采用给药组与对 照组比较,成组t 一检验:体内实验采用给药组、正常对照组与模型对照组比 较,成组t 一检验( 计算由m i c r o s o f t e x c e l 处理) 。 结果 1 D L F 对体外H :O ! 诱导的红细胞氧化性溶血的抑制作用与时效、量效关系 如图l 所示,鼠红细胞与H :0 。在3 7 下孵育6 0 m i n 后,可观察到明显而 迅速的溶血,溶血程度随着时间推移越来越高,孵育1 8 0 m i n 后,红细胞完全 近于溶血,溶血曲线趋于平缓;而加入不同浓度D L F 均能显著地降低红细胞的 溶血率,减缓溶血速度,当D L F 为2 0 0 m g m l 。1 时效果最为明显。 1 2 l O 8 O 6 0 4 O 2 6 01 2 01 8 02 4 0 F i 9 1 T i m e r e s p o n s e c u r v eo ft h ee f f e c to fD L Fo no x i d a t i v eh e m o l y s i so f m o u s ee r y t h r o c y t e si n d u c e db y 如0 2n = 5 ,i S C o n t r o li p O 9 N a c l , D L F J = O m g m 1 1 D L F = I O O m g m 1 1 D L F = 1 5 0 m g m l D L F = 2 0 0 m g m l1 。 如图1 所示,正常对照组于3 7 “ C 下孵育6 0 m i n 后,H 2 0 :诱导的红细胞氧化 性溶血即趋于完全,图2 则说明此时D L F 对H 。0 :诱导的红细胞氧化性溶血的影 响及量效关系。当D L F 剂量为2 0 0 m g m l 。1 时,其溶血程度为对照组的 2 l _ 9 ,而浓度为5 0 m g m l 。4 0 0 m g m 1 1 时,D L F 对H 2 0 z 诱导的鼠红细胞氧 化性溶血均有显著的抑制效果,最佳剂量为2 0 0 m g m l 。 F i 9 2 - I n f l u e n c e so fD L Fo nh e m o l y s i so fm o u s ee r y t h r o e y t e si n d u c e db yH 2 0 2a L 3 7 “ Cf o r6 0 m i n n = 5 ,x s N o t e :v sc o n t r o l ( D L FO m g m l 。) ,u n p a i r e dt t e s t + p 0 0 5 ,”p O O l , + + p O 0 0 1 2 体外实验D L F 对小鼠红细胞的形态影响 F i 9 3 M i c r o g r a p h so fm o u s ee r y t h r o c y t e su n d e rs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e A :N o n n o le r y t h r o c y t e ( D L F ,1 0 0m g m l1 ) B :D a m a g e de r y t h r o c y t e ( D L F 3 0 0m g m l 。1 ) C :C o n t r o l ( D L F 0m g m l 一1 ) D :D L F ( 0m g m l 。) E :D L F ( 1 0 0m g m l 。1 ) F :D L F ( 2 0 0m g m 1 1 ) G :D L F ( 2 0 0m g m l 一1 ) H :D L F ( 3 0 0m g m 1 1 ) 如图3 所示,与H :O :作用后,各组红细胞均受到程度不同的筑化损伤,表 璜勾绍稳貘党游发降低,膜表委爨嚣凸越秘斑获物,部分红细稳鞠鳃,释放穗 内岔物,在显微镜视野下呈现大片的絮状物质,其中对照组( D L F 浓度 O m ;m l 。) 受损鬣为羁显。丽吾D L F 保护组的红纲胞均受到一定酾保护,细胞 形态好于对照组,絮状物质较少,当D L F 浓度为2 0 0 m g m 1 1 时保护作用最为 鞠显,视搿中的巍细胞多清晰可辨,表面光滑,形态完整。 3 ,D L F 对小鬣体内红细胞、自缅徽数目和血红蛋囱含量的影响 如表1 所示,模型
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