南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 穴位贴敷T D D 药贴对哮喘豚鼠C O X 2 、 M M P 9 含量的影响 E f f e c to fa c u p o i n tT D D a p p l i c a t i o no nc y c l o o x y g e n a s e 一2 a n dm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 一9o fg u i n e ap i gw i t hb r o n c h i a l a s t h m a 课题来源：广州市科技攻关计划项目( N O 2 0 0 7 2 3 一E 5 1 2 1 ) 专 业 名称 学位申请人 针灸推拿学 王平平 指导教师王升旭教授 答辩委员会主席 答辩委员会成员 符文彬教授 唐纯志教授 赵仓焕主任医师 汪青春教授 黄泳教授 论文评阅人唐纯志教授 何扬子主任医师 黄泳教授 2 010 年3 月31 目广州 硕士学位论文 f 删删删删删聊舢 Y 1 7 。7 HI l u l i 0 I l l l l 3 r i lJ I | 6 J J I I I l 7 J I I I I 穴位贴敷T D D 药贴对哮喘 豚鼠C O X 一2 、M M P 9 含量的影响 硕士研究生：王平平 指导老师：王升旭教授 摘要 一、研究背景、目的与意义 支气管哮喘( 后文简称哮喘) 是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞、巨 噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞等多种细胞和细胞介质参与的呼吸道慢性炎症。 在我国哮喘是严重影响人们( 特别是儿章和青少年) 健康的常见病，据粗略统计， 我国约有1 5 0 0 万2 0 0 0 万人罹患哮喘。随着城市化，现代生活的进步，近几年 来哮喘患病率有增加的趋势，在我国广州，1 9 9 4 2 0 0 1 年间，1 3 1 4 岁有哮喘症状 的儿章患病率由3 4 增加至9 9 。由于哮喘病情常迁延反复，病程长，故已成为 世界性的健康问题而引起各国的极大关注。近年研究发现，哮喘的发生不仅存 在着气道炎症，还存在着不同程度的气道壁结构改变，即气道重构，气道炎症 与气道重构是哮喘的丽个主要病理学特征。其中气道重构是引起慢性哮喘患者 气道不可逆性阻塞的病理皋础。气道炎症是哮喘产生高反应的本质因素。 环氧化酶2 在炎性反应环节中起着关键作用，已视为快速炎症反应的重要 标志之一。C O X - - 2 主要存在于气道上皮细胞和平滑肌细胞，生理状态下它几 乎不被表达，只有在炎性细胞因子或炎性介质将细胞激活的情况下才被表达。哮 喘患者气道粘膜中有大量的单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润， 被激活后可产生大量的C O X 2 ，C O X 2 是种炎性酶，它的表达诱导多种炎症介质 的表达，这些炎症介质又加重了炎症反应，从而诱发哮喘或使哮喘加重。 细胞外基质( E C M ) 的降解和沉积失衡是导致哮喘患者气道擘结构异常构 摘要 建、肺实质破坏及间质增生的重要原因。研究发现基质金属蛋白酶( M M P s ) 是调 节E C M 代谢的主要限速酶。M M P 9 是M M P 家族的成员之一，正常状态组织表 达极少。在细胞因子刺激下M M P 9 表达上调，细胞外基质降解，导致气道慢性炎 症和气道重塑。哮喘患者M M P 9 表达过度，气道细胞外基质受损，炎细胞向气道 局部浸润，激活基质的生长因子，促进成纤维细胞增生、胶原沉积，最终引起气道重 塑，加重气道炎症。从而引起了哮喘的产生或加重了哮喘。 中医认为哮喘病属于“哮病”范畴，穴位贴敷疗法是中医治疗此病的较有 效疗法之一。穴位贴敷法古称“冷灸”，是把药物研成细末，用液体( 如水、醋、 酒、蛋清、植物油、姜汁等) 调成糊状，或将中药熬成膏剂，直接贴敷于穴位。穴 位贴敷作为外治疗法，对人体的作用机理主要包括药物的直接作用和药物对俞 穴刺激的问接作用两方面。此种疗法为中医治疗哮喘的常用疗法之一，虽疗效 显著但剂型落后。目前，有一一种较新的项目一经皮给药系统，( T D D S ) ，其是药 物经由皮肤吸收进入人体血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防 的一类制荆。这类制剂在欧美国家习称为贴剂，在国内多定名为贴片，这种剂型 较原有穴位贴敷剂型具有药物吸收快、生物利用度高、携带方便等特点。本实 验观察了穴位贴敷经皮给药药贴对哮喘豚鼠血清中C O X 2 水平的影响以及对哮 喘豚鼠支气管肺组织中M M P 9 影响，从而探讨穴位贴敷经皮给药药贴对治疗哮 喘的可能作用机制，并为今后T D D 药贴在临床上推广应用提供理论依据。 二、方法与内容 1 实验动物与分组 4 8 只豚鼠，随机分为正常对照组、模型组、T D D 药贴组和地塞米松组，每组各 1 2 只。 2 实验方法 2 1 致敏：除i F 常对照组外，其余各组均采用鸡卵白蛋白致敏，常规消毒后 次性腹腔注射1 0 0g L 卵白蛋白生理盐水1 m L ，使豚鼠处于致敏状念。第1 8 大丌 始，将致敏的豚鼠置于密闭透明的塑料盒内，给予1 0 L 卵白蛋白生理盐水浑 悬液雾化吸入加以激发，每次每次3 0S ，1 次d ，连续1 4 d 以腹式呼吸明显，呼 硕士学位论文 吸频率加快且节律不整，活动减少等症状为诱喘成功。正常对照组以生理 代替卵白蛋白生理盐水，其致敏及诱喘时间同实验组。 2 2 治疗：T D D 药贴组将T D D 药贴敷贴于豚鼠大椎、双肺俞、双肾俞进 疗。地塞米松组采用穴腹腔注射地塞米松进行干预治疗。模型对照组和正 照组不给予任何干预治疗。观察各组豚鼠哮喘发作时的症状轻重程度以及 次数。 2 3 取材及制作标本：在末次诱喘后2 4h 内，给豚鼠称体质量，用3 0 L 比妥钠，按5 0m g k g 腹腔注射麻醉豚鼠，迅速断头取血，每只取5m L ，然 温放置2h 后，30 0 0r m i n 离心1 5m i n ，取上清液，放冰箱一2 0 保存待测。在 断头取血同时，立即迅速打丌胸腔，暴露肺及- t l , 脏，常规取支气管肿组织( 右中下 肺，包括肺门) ，避免钳夹组织引起组织受压影向观察，取材部位：右中下肺取一横 切面，包括肺门。所取组织经1 0 0 m l L 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋和切片( 厚4u m ) ，等待测量。 2 4 指标检测：实验结束后，采用酶联免疫吸附法定量检测每只豚鼠血清中C O X 2 水平，采用免疫组化法测定支气管肺组织M M P 9 蛋白表达。 2 5 统计方法：所有实验数据均在S P S S1 3 0 上建立数据库、进行数据录入与统 计分析。各组间差异采用单向方差分析( O n e W a y A N O V A ) ，方差齐用L S D 检 验，方差不齐用T a m h a n e S 检验。 2 6 分析数据，得出结论。 三、结果 1 在造模及治疗阶段：T D D 药贴组死亡6 只，模型组死亡6 只，地塞米松组死 亡4 只，正常对照组死亡豚鼠2 只。 2 穴位贴敷T D D 药贴对哮喘豚鼠血清中C O X 2 水平的影响 采用酶联免疫吸附法定量检测血清中C O X 2 含量的结果表明：模型对照组 豚鼠血清中C O X 2 含量显著高于正常对照组( P 2 0 0 m I ) 。 4 硕士学位论文 P E F 日内变异率或昼夜波动率至2 0 。 符合以上( 1 ) ( 4 ) 条或( 4 ) 、( 5 ) 条者，可确诊为哮喘病。 5 哮喘的西医治疗： 5 1 病因治疗若能找到引发哮喘的变应原或其他非特异刺激因素，则使患者 脱离变应原的接触是治疗哮喘最有效的方法。 5 2 平喘药物的应用恰当的使用这类药物可有效控制哮喘的发作，临床常用 的几类平喘药主要有： 5 2 1 糖皮质激素糖皮质激素是目前对于各个年龄组的慢性持续期哮喘患 者，无论其病情严重程度如何，都是长期使用最有效的控制性药物。主要作用于靶 细胞，它能够通过抑制气管炎症而有效地控制支气管哮喘症状。常用的口服糖皮 质激素类药物主要有泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙等。【3 】 5 2 2 1 32 受体激动剂主要通过对气道的平滑肌和肥大细胞表面的1 32 受体 的兴奋，激活腺苷酸环化酶，使细胞内的环磷腺苷含量增加，游离C a 2 + 减少， 从向松弛支气管平滑肌，是控制哮喘急性发作的首选药物。目前常用的有沙丁 胺醇、特和他林、克仑特罗、丙卡特罗、福莫特罗、沙美特罗等。 5 2 3 白j 烯调节剂白三烯调节剂也是哮喘治疗有效药物，可用丁二持续性未 控制哮喘患者的治疗。白三烯是哮喘发病过程中最重要的炎症介质，它不仅能 收缩广毛道甲滑肌，且能促进炎症细胞在气道聚集及促进气道上皮、成纤维细胞 等增殖，从而参与气道炎症和重构的过程。该类药物主要有孟鲁司特、扎鲁司 特和本噻羟脲等。 5 2 4 抗胆碱药抗胆碱药能抑制气道平滑肌M 受体，阻断节后迷走神经通 路，降低迷走神经兴奋性而起舒张支气管作用，并有减少痰液分泌的作用。主 要药物有异丙托溴胺、氧托溴胺、噻托溴铵等。 5 2 5 茶碱类茶碱类除能抑制磷酸二酯酶，提高环磷酸腺苷在细胞内的浓 度外，同时具有腺苷受体的拮抗作用，刺激肾上腺分泌。肾上腺素，增强呼吸肌 的收缩；据资料显示低浓度茶碱具有抗炎和免疫调节作用目前常用的药物有： 茶碱、氨茶碱、双羟丙茶碱及多索茶碱等。 第一章前言 哮喘在中医学中属哮证、哮病、呷嗽等范畴，内经虽无病名，但有“喘鸣”、 “朐”之类的记载。金匮要略称之为“上气”：“咳而上气，喉中水鸡声，射 干麻黄汤主之。”并从病理上将其归属于痰饮病中的“伏饮”证。元朝朱丹溪 首创“哮喘“ 病名，在丹溪心法中，哮喘被作为独立的病名成篇，并对其 治法、用药原则等作了具体的论述。祖国医学中关于哮喘的治疗方法有很多， 如口服中药、针灸、拔罐等， 4 1 - 【6 】其中穴位贴敷疗法是较有效的方法之一。此法 最早的记载可追溯到马王堆汉墓帛书五十二病方：“虫元见于以蒯角 印其中颠”，指用芥子泥贴头顶中央治病的冷灸之法。天灸法一词，则见于针 灸资生经卷三：“乡居人用旱莲草椎碎，置在手掌上一夫，当两筋中，以古 文钱压之，系之以故帛，未久起小泡，谓之天灸，尚能愈疟”。宋以后，随着 天灸用药的多样化，其治疗疾病也不单单局限在疟疾。 7 1 晚清“外治之宗吴师 机对天灸疗法的叙述最为详尽，从贴敷的药物种类、穴位选择及中医作用机理 都有详细的论述，对后世应用天灸疗法具有指导和启发意义。 传统的穴位贴敷疗法一直沿用至今，虽疗效显著，但仍存在较难控制准确给 药剂量等问题。迫切需要我们寻找新的剂型以弥补这些不足。 经皮吸收制剂或称经皮给药系统( T m n s d e r m a l T h e r a p e u t i c S y s t e m ， T T S ；T r a n s d e r m a lD r u g D e l i v e r yS y s t e m ，T D D S ) 是指在皮肤表而给药，使药物以恒 定速度( 或接近恒定速度) 通过皮肤各层，进入体循环产生伞身或局部治疗作用的 新制剂或系统。经皮给药制剂可避免肝脏的首过效应及被胃肠道破坏，减少给 药次数，延长给药时间，维持恒定的有效血药浓度，降低药物的毒副作用，提高 疗效，便于使用。【8 J 所以我们选用对哮喘豚鼠穴位贴敷T D D 药贴的方式，以观察其血清中 C O X 2 水平及支气管肺组织中M M P 9 水平，探讨穴位贴敷T D D 药贴治疗哮喘 的可能作用机制。 6 腹腔注射1 0 0g L 卵白蛋白生理盐水l m L ，使豚鼠处于致敏状态。【9 】第1 8 天丌始， 将致敏的豚鼠置于密闭透明的塑料盒内，给予1 0 L 卵白蛋白生理盐水浑悬液 雾化吸入加以激发，每次3 0