第一章 前 言 硕 士 学 位 论 文 糖多孢红霉菌糖多孢红霉菌 A226G-突变体的构建及恢复突变体的构建及恢复 Construction and Complementation of Saccharopolyspora erythraea A226G- Mutant 姓姓 名名 袁袁 华华 学科专业学科专业 生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学 研究方向研究方向 基因工程药物基因工程药物 指导教师指导教师 张部昌张部昌教授教授 完成时间完成时间 2008 年年 5 月月 摘 要 糖多孢红霉菌糖多孢红霉菌 A226G-突变体的构建及恢复突变体的构建及恢复 摘摘 要要 红 霉 素 （ erythromycin, Er ） 是 由 革 兰 氏 阳 性 细 菌 糖 多 孢 红 霉 菌 （Saccharopolyspora erythraea） 合成的次生代谢产物， 为一类大环内酯类抗生素， 包括红霉素 A（ErA）、红霉素 B（ErB）、红霉素 C（ErC）、红霉素 D（ErD） 等，它们结构相似，而且均有抑菌活性，其中 ErA 在临床上具有广泛的用途， 其抑菌活性最高，而且毒性也最小。 在糖多孢红霉菌中，负责红霉素生物合成的基因均以单一拷贝、成簇形式 存在于环形染色体上， 质粒不参与红霉素的生物合成。 糖多孢红霉菌红霉素3“-O- 甲基转移酶（EryG）是一种 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基化酶，在 ErA 生物合成过程中对中间产物 ErC 和 ErD 进行甲基化修饰，从而在提高红霉素的 活性和降低红霉素的毒性方面起着重要的作用。 为研究糖多孢红霉菌红霉素 EryG 的相关酶学性质提供一个体内研究系统， 构建了糖多孢红霉菌红霉素 EryG 编码基因 eryG 失活的突变体 A226G-，在 A226G-突变体中 eryG 基因已彻底失活，其编码产物 EryG 不再具有甲基转移酶 活性。 以糖多孢红霉菌 A226 基因组 DNA 为模版， 用重叠 PCR 方法扩增出去除红 霉素 EryG SAM 结合位点 DNA 序列在内 290bp 的约 1 600bp DNA 片段， 克隆到 同源重组质粒 pWHM3 中，构建了 pWHMeryG。PEG 介导原生质体转化法将 pWHMeryG 质粒转入糖多孢红霉菌 A226 中， 通过染色体同源重组整合到 eryG 基因位点上， 用 PCR 方法筛选出糖多孢红霉菌整合体 A226:pWHMeryG 和 。薄层层析（TLC）和质谱（MS）结果表明在 A226:pWHMeryG 中质粒 pWHMeryG 整合在 eryG 基因删除位点的上游， 而在 A226:pWHMeryG 中 质粒 pWHMeryG 整合在 eryG 基因删除位点的下游。糖多孢红霉菌整合体 A226:pWHMeryG 在无抗 R3M 斜面培养基上连续生长三代后，制备原生质 体涂无抗 R3M 平板，用 TLC、PCR 和 MS 方法筛选出一株糖多孢红霉菌红霉素 糖多孢红霉菌 A226G-突变体的构建及恢复 II eryG 基因失活的突变体 A226G-，此 eryG 基因突变体仅能生产中间产物 ErC 而 不再合成末端产物 ErA，从而说明 A226G-突变体中 eryG 基因已彻底失活，其编 码产物 EryG 不再具有甲基转移酶活性。 为克隆、表达糖多孢红霉菌红霉素 eryG 基因，以糖多孢红霉菌 A226 基因 组 DNA 为模板，PCR 扩增出 eryG 基因序列，克隆到原核表达载体 pET-22b(+) 上，构建了 pETG。诱导表达结果发现糖多孢红霉菌红霉素 eryG 基因可以在大 肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达，随后，将红霉素 eryG 基因亚克隆至糖多孢红 霉菌染色体整合型表达载体 pZMW 上，构建了 pZMWG。PEG 介导原生质体转 化法将 pZMWG 转入糖多孢红霉菌 A226G-突变体中， 用 PCR 方法筛选出糖多孢 红霉菌基因工程菌株 A226G-G+。TLC 结果发现通过 eryG 基因的功能补偿，糖 多孢红霉菌突变体 A226G-恢复了 ErA 的合成能力，但产量比出发菌株 A226 要 低。 具有抗寄生虫、病毒和细菌活性的巨大霉素（megalomicin）和 ErA 有着共 同的生物合成中间产物 ErC，所以本研究成功构建的糖多孢红霉菌 A226G-突变 体以及克隆的糖多孢红霉菌红霉素 eryG 基因，不但为进一步深入研究 EryG 的 相关酶学性质奠定了基础，而且也为巨大霉素生物合成 ErC 相关的修饰酶类提 供了一个体内研究系统。 关键词关键词：糖多孢红霉菌；红霉素；EryG；同源重组；功能补偿 ABSTRACT III Construction and Complementation of Saccharopolyspora erythraea A226G- Mutant ABSTRACT Erythromycins (Er) are macrolide antibiotics, produced by the Gram positive bacterium Saccharopolyspora erythraea, including erythromycin A (ErA), erythromycin B (ErB), erythromycin C (ErC) and erythromycin D (ErD). They all possess antimicrobial activities, but only ErA is widely used in clinic for its most antimicrobial activity and least cell toxicity. The genes responsible for the erythromycin biosynthesis are clustered on the Sac. erythraea circular chromosome, each existing as a single copy, and plasmids are not involved in the erythromycin biosynthesis. Sac. erythraea erythromycin 3“-O-methyltransferase (EryG), a kind of S-adenosylmethionine (SAM) dependent methylase, plays a great role in the erythromycin biosynthesis, which, by methylating ErC and ErD, could increase the erythromycin antimicrobial activity and decrease erythromycin-caused cell toxicity. In order to provide an in vivo system for EryG enzymatic property studies, a Sac. erythraea A226G- mutant was constructed, which no longer synthesized the terminal product ErA but its intermediate ErC. Taking Sac. erythraea genomic DNA as the template, about 1 600bp DNA fragment without a DNA sequence of 290bp within erythromycin eryG gene which contained DNA sequence for the SAM binding domain was amplified by overlap PCR technique, and cloned into the vector pWHM3 to construct a homologous recombination plasmid pWHMeryG. The plasmid pWHMeryG was introduced into Sac. erythraea by PEG-mediation, and two integrants (and ) were obtained 糖多孢红霉菌 A226G-突变体的构建及恢复 IV by PCR identification. After integrant had grown for three generations on R3M media without thiostrepton (Thio), they were protoplasted and plated on R3M media without Thio. One Sac. erythraea mutant, A226G-, was screened and identified by Thin Layer Chromatography (TLC), PCR and Mass Spectrometry (MS). The A226G- mutant could accumulate ErC instead of ErA in its fermentation culture. To clone and express Sac. erythraea erythromycin eryG gene, taking Sac. erythraea genomic DNA as the template, the eryG gene fragment was amplified by PCR technique, and cloned into the prokaryotic expression vector pET-22b(+) to construct pETG. The plasmid pETG was introduced into Escherichia coli BL21(DE3) and the results showed that the erythromycin eryG gene could be induced to be expressed efficiently. Then the eryG gene fragment was subcloned into the Sac. erythraea chromosomal integration vetor pZMW to construct pZMWG. The plasmid pZMWG was introduced into Sac. erythraea A226G- mutant by PEG-mediation, and engineering strains A226G-G+ were selected by PCR indentification. TLC results showed that the erythromycin eryG gene of pZMWG could restore A226G- to synthesize ErA, but the Er yield was somewhat lower than that of its parent strain A226. Megalomicin is a therapeutically diverse compound which possesses antiparasitic, antiviral and antibacterial properti