实验一、氨基酸的分离鉴定,纸层析法,一、实验目的,通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作技术。,二、实验原理,纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。利用不同物质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离。 展层剂由有机溶剂与水组成。在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，当有机相沿纸流动经过层析斑点时，层析点上的溶质就在有机相和水相之间进行分配。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动方向移动，不断进行分配，溶质中各组分的分配系数不同，移动速率不同，因而彼此分开。,各组分由于移动速度不同，物质被分离后在层析纸上的位置也不同，可用Rf 值来表示： 原点到层析点中心距离 Rf 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某物质的Rf值是常数，可作为定性分析的依据。 Rf 值大小与样品物质的结构性质、溶剂系统、层析滤纸的质量及展层方式、温度、样品溶液中的 杂质等因素有关。,物质结构与性质,物质的极性大小决定了物质在水和有机相之间的分配情况，其极性的大小主要取决于物质所具有的极性基团的性质和数量，在极性基团不改变情况下，非极性基团成分越多，则分子极性越低等。,同一物质在不同的溶剂系统中，Rf 值不同。在同一溶剂系统中，溶剂各组分比例不同时， Rf 值也有差别。溶剂系统选择应注意以下原则： 1）通常选用与水部分混溶的有机溶剂或与水相混溶的其他溶剂作为展层剂。 2）溶剂系统应选相对稳定二元或多元混合溶剂，各成分之间不起化学反应，挥发性太大的溶液不宜作溶剂。 3）样品分离各组分一般Rf 值0.050.85之间，彼此间差值不应小于0.05，样品与标样差值0.05基本确认为同一种物质。 4）溶剂的规格应选用色谱纯或分析纯，必要时重新蒸馏。,溶剂系统,展层方式,上行法 下行法 环形法 (辐射法）,三、器材,层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸,四、试剂,1、扩展剂：按体积4:1:3的正丁醇：冰醋酸：水混合后倒入分液漏斗中，充分振荡，静置后分层排出水相 50 ml /组 2、平衡剂：取漏斗中的扩展剂5ml 于烧杯中作平衡剂。 3、氨基酸：0.5%赖、脯、缬、苯丙、亮氨酸溶液及各组分的混合氨基酸各5ml。 4、显色剂： 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 200ml 全班,五、操作,1、取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2-3cm处用铅笔画一条直线，在此线上每间隔2cm作一记号（即原点）如图。 2、点样：用钢笔或毛细管将氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径不超3mm。点样量应根据样品的性质及滤纸的长度来决定，一般点样量为530ug 。,溶剂前沿 层析点 原点,3、平衡：点样好的滤纸卷成圆筒状用线缝好与盛有平衡剂的小烧杯，置于密闭的层析缸中，平衡1-2小时。 4、扩展：将盛有约20ml左右扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中，密闭好层析缸。待溶剂上升到1520cm时即取出滤纸，立即用铅笔描出溶济前沿，吹风机或烘箱干燥。,图1-2 滤纸缝合示意图,5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1% 的茚三酮正丁醇溶液，干燥。 6、计算：用铅笔描出各层析斑点的轮廓，并计算各氨基酸的Rf 值。,图谱显示,化学方法：显色剂不与滤纸起反应，挥发性小，易于去除，含水量少。 物理方法 微生物方法 同位素和放射自显影法,注意事项： 1、要保证层析滤纸不被污染，特别是从点样线到溶剂前沿的部分。 2、各氨基酸样品点样时量要均匀。 3、在缝滤纸时，纸的两边不能接触。 4、点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线1cm。,六、实验结果,七、分析讨论,八、思考题,做好本实验的关键是什么？ 实验过程中，为何不能用手直接接触滤纸? 影响 Rf值的因素有哪些？,