分类号 密级公开 国际十进分类号（UDC） 第四军医大学 学 位 论 文 ASCs 复合PRF 促进自体移植脂肪血管化 的实验研究 （题名和副题名） 李 龙 （作者姓名） 指导教师姓名 刘 斌 教授（主任医师） 刘彦普 教授（主任医师） 指导教师单位 第四军医大学口腔医院颌面外科 申请学位级别 硕士 专业名称口腔临床医学（颌外） 论文提交日期 2012.04 答辩日期2012.05 论文起止时间 2011 年 3 月至 2012 年 4 月 学位授予单位 第四军医大学 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业 离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外） ，可以采 用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅， 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入中 国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中国知识资源总库 ，同意按 中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 脂肪干细胞复合富血小板纤维蛋白促进自体移植 脂肪血管化的实验研究 脂肪干细胞复合富血小板纤维蛋白促进自体移植 脂肪血管化的实验研究 研 究 生：李 龙 学科专业：口腔临床医学（颌外） 所在单位：第四军医大学口腔医院颌面外科 导 师：刘 斌 教授（主任医师） 刘彦普 教授（主任医师） 资助基金项目：国家自然科学基金资助项目两项（81070820，31170942） 关 键 词: 脂肪干细胞；富血小板纤维蛋白；脂肪移植；血管化； 存活率/吸收率 中国人民解放军第四军医大学 二 O 一二年四月 第四军医大学硕士学位论文 目 录 缩略语表1 中文摘要3 英文摘要7 前 言12 文献回顾14 一、脂肪移植的研究现状及存在问题 14 二、脂肪组织工程的产生及研究现状 16 三、脂肪干细胞在作为脂肪组织工程种子细胞的研究现状 18 四、富血小板纤维蛋白研究现状 19 五、实验构想及设计 20 正 文21 脂肪干细胞复合富血小板纤维蛋白促进自体移植脂肪血管化的实验研究 21 实验一 ASCs 的体外分离培养及鉴定 21 实验二 PRF 体外对 ASCs 的相关特性影响研究 .30 实验三 兔 ASCs 和 PRF 复合自体脂肪颗粒体内移植实验 38 结果讨论51 全文总结60 参考文献62 附 图74 个人简历和研究成果87 致 谢89 第四军医大学硕士学位论文 1 缩略语表缩略语表 缩略词缩略词 英文全称英文全称 中文全称中文全称 AG adipose granule 脂肪颗粒 ASCs adipose-derived stem cells 脂肪干细胞 bFGF ibroblast growth factor 成纤维细胞生长因子 BMSCs bone mesenchymalstemcells 骨髓间充值干细胞 CAL cell-assisted lipotransfer 细胞辅助移植技术 EGF epidermal growth factor 表皮生长因子 GFs growth factors 生长因子 (H PRF；Adipose Tissue Engineering；Fat transplantation； vascularization；Survival rate 第四军医大学硕士学位论文 12 前前 言言 随着社会经济的快速发展，国民生活水平的不断提高，人们更加注重 个人形象和气质，对美学要求越来越高。因此人们对于先天性畸形、外伤 及肿瘤等各种原因所造成的颌面部及全身软组织的缺损畸形，迫切需要一 种安全有效的填充材料和修复治疗的方法。临床上对于组织缺损修复，曾 使用各种生物材料如膨体聚四氟乙烯，硅胶等，但由于各种并发症如感染、 移位和过敏反应等而限制其在临床上的应用和推广。脂肪组织作为自体组 织替用品，是较为理想的组织缺损修复的填充材料，其来源充足取材方便， 可塑性高，且作为自体组织可避免免疫排斥反应和交叉感染的可能。对于 患者而言，损伤较小且疼痛轻，所需费用较低，因此脂肪组织具有较高的 临床应用价值和前景。 但因单纯脂肪组织移植后常常出现吸收液化坏死等并发症造成移植脂 肪存活低，且临床上缺乏统一的标准，脂肪移植的应用和推广一度受到限 制。因此如何提高移植脂肪的成活率和改善脂肪移植术的方法是目前各研 究领域的热点之一。近年来随着组织工程技术和干细胞技术的不断发展， 脂肪移植术也得到了突飞猛进的发展。脂肪组织工程技术是通过复合种子 细胞、支架材料和相关生长因子，创建新的适合组织存活的微环境来提高 移植脂肪的存活率。而如何构建理想的脂肪组织工程移植材料，又是众多 学者目前面临的一大难题。 组织工程种子细胞来源有多种，目前较为热门的为骨髓间充质干细胞 (BMSCs)和脂肪干细胞(ASCs)。但两者相比，ASCs 更显优越性，ASCs 来 源丰富， 取材方便， 操作便捷， 同时大量研究也证实 ASCs 有诸多与 BMSCs 相似的干细胞特性1，具有更强的自我更新和增殖能力， 体外能向多细胞系 分化，如向脂肪细胞、神经细胞、血管内皮细胞和成骨细胞分化等多向分 第四军医大学硕士学位论文 13 化潜能2， 研究还表明 ASCs 体内还能释放多种促进组织愈合和修复的生长 因子3。 因此ASCs作为脂肪组织工程种子细胞在脂肪移植中具有巨大前景。 富血小板纤维蛋白(PRF)作为新一代的血小板浓缩剂，与传统富血小板 血浆(PRP)相比具有操作便捷，成本低廉，安全有效等优点。PRF 内含丰富 的生长因子4和多种细胞因子，及其特殊的立体纤维蛋白空间结构5,6，能 为种子细胞提供理想的细胞支架和适宜生长的微环境。 本实验研究通过体外分离培养家兔脂肪组织的脂肪干细胞建立兔来源 的脂肪干细胞，然后通过复合自体 PRF，与自体脂肪颗粒混合进行移植， 进一步探讨 PRF 与 ASCs 改善脂肪移植效果及其相关机理，为构建一种安 全有效、操作便捷和价格低廉的新型脂肪移植材料提供理论和实验基础。 第四军医大学硕士学位论文 14 文献回顾文献回顾 一、脂肪移植的研究现状及存在问题一、脂肪移植的研究现状及存在问题 探索理想的治疗方法来修复重建颌面及全身软组织缺损畸形和整形外 科，一直以来是人们关心的热点问题。20 世纪 80 年代以前，脂肪移植作为 软组织缺损修复的手段存在着较大的争议。Neuber 等人首次利用脂肪组织 作为自体组织进行的脂肪移植，随后 Czerny 7，Lexer 8，and Rehn 9等对 脂肪移植也进行了大量的研究。 1911 年， Bruning 10首次通过注射的方法将 脂肪颗粒注射到皮下进行软组织缺损修复重建，尽管注射的脂肪组织出现 较大的吸收，但也推动了脂肪移植术的进一步发展。1956 年，Peer11等通 过相关研究证实移植脂肪的存活率高达 50%，且提出了移植脂肪的细胞存 活理论。随后随着自体脂肪颗粒注射移植术的发展，出现了多种不同的技 术方法，在如何通过最佳的方法获取脂肪组织来提高脂肪移植后的活性和 存活等方面一直未能达成统一的标准。直到 20 世纪 90 年代，Illouz 和 Fournier12,13等提出了脂肪抽脂术，抽脂术的出现使得获取脂肪的方法更加 便捷和省时，进一步推动了脂肪移植术的发展。利用脂肪抽脂术在填充颌 面部14,15及全身其他表浅组织缺损16取得了较好的效果。 关于自体脂肪移植长时期内处于富于争议的境地，脂肪移植的最大缺 陷在于其远期效果常常较差， Illouz 等对 167 例自体脂肪注射移植的病人移 植远期效果跟踪调查结果发现移植脂肪几乎吸收完全17，Horl 报道中移植 脂肪组织的吸收率竟有高达 70%18。传统的脂肪移植效果很大程度上限制 了脂肪移植术的发展。 Guerrerosantos19将脂肪组织移植到大鼠皮下和肌肉两个不同部位发 现，肌肉部位的脂肪组织能存活较长时间且保持较稳定的体积，而皮下的 第四军医大学硕士学位论文 15 脂肪组织几乎吸收完全。Eppley也发现20注射到颜面部肌肉部位的移植脂肪 组织有较好的存活特性，取得较为理想的修复效果。1986 年 Smahel21通过 对大量文献报道的脂肪移植的组织学综述归纳分析，发现移植脂肪组织一 部分是由于宿主反应作用减低而存活，一部分由于移植的脂肪组织在特定 条件下相互作用形成一整合体而存活，而剩余的移植脂肪组织则卷入组织 的水肿炎症反应。 关于移植脂肪的存活理论有多种假设，但大量的动物实验研究结果 22-25显示较为认同的理论为 Peer26细胞存活理论。根据 Peer 的细胞理论， 许多研究者提出将移植的脂肪组织预先经过相关生长因子的处理来提高移 植脂肪的存活。Eppley 及其研究团队成员27,28通过将脂肪组织与成纤维细 胞生长因子(fibroblast growth factor, bFGF)和葡聚糖微球颗粒(Dextran beads) 预处理， 在大鼠的脂肪移植实验中发现能有效提高脂肪存活率。 也有 Bircoll 29、 Silkiss 和 Baylis 30等人尝试将胰岛素与脂肪组织混合进行脂肪移植， 但结果较为失望而放弃此种方法。 Boyce31及其合作者提出利用脂肪前体细 胞及相关激素混合脂肪组织进行脂肪移植可能提高移植脂肪的远期存活效 果。 Asaadi 和 Haramis32通过对应用此方法移植的 5 年随访效果观察， 发现 应用此方法的进行的脂肪移植取得较为满意的临床效果。McFarland33等又 提出，脂肪组织的大小很大程度上影响脂肪移植后的存活率。 Schorr34等人 的研究结果也表明,较小脂肪块的移植比大块脂肪块远期存活效果要好。 Carpaneda 和 Ribeiro35的经验表明， 当移植脂肪颗粒直径大小超过 3mm 时， 移植脂肪的存活率会明显降低,他们的研究发现移植脂肪获取营养的方式是 在血管发生边缘约 1.5mm 大小范围内通过附着与扩散作用来获取，因此他 们的经验建议移植脂肪大小在 3mm 作用，对血管再生余留足够的空间促进 脂肪的存活。对于移植脂肪组织的寿命和脂肪前体细胞的存活，很多研究 者认为与脂肪组织的获取方法，移植前对脂肪组织的处理方式等有关。直 到2000年, Sommer和Sattler 36提出移植脂肪的存活很多程度上与脂肪组织 第四军医大学硕士学位论文 16 的获取方法，注射的方式及评估方式等关联不大，而与脂肪组织的纤维化 程度，具有活力细胞的数量多少，受区组织血供改建情况、解剖学特点和 迁移性，及潜在疾病的并发症的风险等有密切关系。2001 年，Shoshani 和 coworkers37将脂肪组织存放于-20条件下，2 周后取出移植到裸鼠皮下， 与常规获取脂肪组织组比较发现，低温条件下保存的脂肪组织仍能存活， 且在组织学形态和体积变化上与对照组没有明显的差异。 2002 年， Coleman