中药材中药材DNA条形码分子鉴定条形码分子鉴定指导原则指导原则 1. 背景背景 中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、 性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、 准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。 2. 定义及原理定义及原理 DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列 来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于 DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同 顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够区分不同物种。 中药材DNA条形码分子鉴定是以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法 体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为辅助序列，动物类 中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列，符合中药材鉴定简单、精确的特 点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。本指导原 则用于规范中药材DNA条形码分子鉴定法，为其应用提供指导。 3. 适用范围适用范围 适用于中药材(包括药材、药材粉末及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。 4. 方法流程方法流程 中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、 测序、 序列拼接及结果判定， 以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。 1）供试品处理供试品处理 除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10-100 mg备用。 具体见各药材项下。 2）DNA提取提取 DNA的提取包括破碎细胞壁、释放DNA，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、 沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA提取试剂盒 和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。 由于植物类中药材种类繁多， 可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加 以改进。植物细胞内储存了大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提 取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重 影响DNA提取的产量与质量， 以及后续的PCR扩增实验。 -巯基乙醇是抗氧化剂， 在提取DNA过程中加入-巯基乙醇，可以抑制氧化反应，避免褐化。PVP(聚乙 烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚， 减少DNA提取过程中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。因此 将PVP和-巯基乙醇配合使用， 能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污 染。EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNase(DNA酶)活性；CTAB(十 六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与DNA形成复合 物。 在天然状态下， DNA与蛋白质以DNP(DNA蛋白质复合物)的形式存在， CTAB 可使细胞中的DNA蛋白质复合物释放出来，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)能充分溶解，存在于液相中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚 类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。 根、根茎、茎木类、皮类根、根茎、茎木类、皮类 通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高，在研磨 时多酚极易氧化成醌类，在纯化过程中很难去除，使DNA带有一定颜色，影响 后续的PCR反应， 所以在提取根及根茎类药材DNA时一定要注意多糖、 多酚的去 除。提取根及根茎类药材DNA时水浴时间一般为90分钟，对于质地坚硬的根、 根茎类和茎木类药材，可以采用延长水浴时间，如56水浴过夜，使得DNA充 分释放到缓冲溶液中。此外，根茎类药材由于富含纤维和贮藏物质，需较多样品 量才能提取到足量DNA，可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。皮类中药材组 织中富含薄壁组织和纤维等，加液氮不易研磨成细粉，需适当增加样品量，同时 应增加-巯基乙醇和PVP的使用量。 叶、花、全草类叶、花、全草类 该类药材采用试剂盒一般都能成功提取其DNA，对于保存 时间较久的叶、花、全草类药材可适当增加水浴时间，同时适当降低水浴温度， 如56水浴过夜等。 果实、种子类果实、种子类 果实及种子类中药材中多富含油脂，研磨时易被氧化，且易 粘着在研钵壁上，损失较大，提取时需增加样品量。另外，对研磨后的材料可用 丙酮浸提，去除脂溶性酚类化合物。 动物药材动物药材 肌肉类动物药材如海龙、蛇类、蛤蚧等，需进行紫外杀菌处理， 并且需要充分磨碎。含有脂类较多的动物内脏器官如蛤蟆油，首先用不含蛋白酶 K和SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液浸泡药材，SDS是一种阴离子表面活性剂， 在5565条件下能裂解细胞，释放出核酸；然后在试剂盒消化缓冲液中增加 SDS含量，有利于脱去脂类。骨甲类药材如龟甲、鳖甲和鹿茸等，由于DNA含量 较低，样品量要适当增大，也可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。 3）PCR扩增扩增 植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物类中药材及其 基原物种扩增COI序列， 通用引物及扩增条件如下， 具体如有改变见各药材项下。 ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3；反向 引物ITS3R：5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。psbA-trnH序列扩增正向引 物psbAF： 5-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3； 反向引物trnHR： 5-CGCGCA- TGGTGGATTCACAATCC-3。COI序列扩增正向引物HCO2198：5-TAAACTT- TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3； 反向引物LCO1490： 5-GGTCAACAAATCA- TAAAGATATTGG-3。 PCR反应体系以25 L为参照， 包括： 1 PCR缓冲液(不含MgCl2)， 2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.1 mol/L引物对，模板DNA，1.0 U Taq DNA聚合 酶，加灭菌双蒸水至25 L。设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。 ITS2序列扩增程序：94 5 min；94 30 s，56 30 s，72 45 s，40个 循环；72 10 min。psbA-trnH序列扩增程序：94 5 min；94 1 min，55 1 min，72 1.5 min，30个循环；72 7 min。COI序列扩增程序：94 1 min； 94 1 min，45 1.5 min，72 1.5 min，5个循环；94 1 min，50 1.5 min， 72 1 min，35个循环；72 5 min。 4）PCR产物检测产物检测 采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。电泳后，PCR产物应在相应的DNA 条形码序列长度位置(具体见各药材项下)出现一条目的条带，阴性对照应无条 带。 5）测序）测序 使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序， PCR扩增引物作为测序引物， 测 序原理同Sanger测序法。有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定。 6）中药材）中药材DNA条形码序列获得条形码序列获得 （1）序列拼接 对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接， 去除引物区， 获得相应的DNA 序列。 （2）序列质量与方向 为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果 两端的低质量序列。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。 7）结果判定）结果判定 将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统( )或 GenBank数据库中应用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法进行结果 判定， 结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种。如果植物类 药材ITS2序列比对后最接近的物种为真菌，则需采用psbA-trnH序列重复上述方 法流程。 （1）中药材DNA条形码鉴定数据库系统鉴定操作流程 登录中药材DNA条形码鉴定数据库系统网站， 在主页点击“物种鉴定”。 根据 需鉴定物种的种类，选择对应的鉴定数据库，如点击植物类药材鉴定(ITS/ITS2)。 将需要鉴定的物种序列复制后粘贴到“植物类药材鉴定(ITS/ITS2)”的序列输入 栏，点击“提交”按钮，进行BLAST鉴定。在BLAST比对结果中，在“序列比对信 息”栏查看相关比对信息， 在“物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。 （2）GenBank数据库BLAST鉴定系统操作流程 登录GenBank数据库BLAST鉴定系统(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)， 在Basic BLAST中选择nucleotide blast， 在Enter Query Sequence中粘贴需要鉴定的 序列(Query)(建议用fasta格式)。在Choose Search Set中选others(nr etc.)数据库，点 击左下角BLAST。 在BLAST结果中查看序列相似性最高(Max ident)的物种， 一般 为与查询序列最接近的物种。 5. 中药材中药材DNA条形码数据库构建原则条形码数据库构建原则 建立中药材DNA条形码数据库时，应在药材原产地及主产地采集供试品， 采用经典分类方法确定其基原，采集样本尽可能覆盖其分布区，每个物种采集来 自不同产地样本20份以上。根据具体药材测定ITS2或psbA-trnH或COI等DNA条 形码序列，分析确定该药材DNA条形码序列种内变异大小。对实验获得或 GenBank中的中药材DNA条形码序列必须经过核准后方可录入中药材DNA条形 码数据库，同时需定期对数据库进行更新。 6. 方法学验证方法学验证 1）影响因素考察 考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取(样品量、水浴温度 和水浴时间)、PCR条件(变性时间、退火温度与时间及延伸时间)及产物纯化(考 察不同纯化试剂盒)，保证实验方法的准确性。 2）精密度考察 （1）重复性 至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评 价。实验结果判定应基本一致。 （2）中间精密度 考察实验室内部条件改变(如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间) 对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。 （3）重现性 实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA条形 码序列应相同。 3）方法适用性考察 采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累 数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。 4）基原物种对比验证 以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获得DNA条形码数据， 与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等污染，保证结果 准确性。 7. 注意事项注意事项 1）实验场所应具备分子生物学实验室的基本条件。 2）中药材DNA条形码分子鉴定法暂不适用于混合物及炮制品的鉴定。 3）为防止外源真菌污染，实验前须将实验用具进行高压灭菌，并用75%乙醇擦 洗药材表面。 有些药材本身含有内生真菌， 如果内生真菌存在于药材的外围组织， 则选用内部组织进行实验。 如果真菌遍布整个药材， 植物类药材需选用psbA-trnH 条形码(真菌内不含有该基因片段)，不能选用ITS2序列。为进一步确保实验结果 不被真菌污染， 研究者可在GenBank数据库应用BLAST方法对所获ITS2序列进行 检验，以确保序列鉴定准确。 4）中药材DNA条形码分子鉴定法不用于确定药用部位。DNA条形码分子鉴定是 利用通用DNA序列来进行物种鉴定，因此该方法可鉴定药材的基原物种，而不 能确定药用部位。 5）种内阈值的确定。同一物种的不同样品间存在一定的变异范围，即种