Chapter 7色谱技术Chromatography,本章主要知识点,什么是色谱分离技术？色谱分离技术的分类什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？吸附色谱及其分类和基本原理什么是分配色谱？离子交换色谱的分类及应用,凝胶色谱的分离原理及分类离子交换及疏水作用层析的原理高效液相色谱的分离原理及应用蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？,色谱技术（分配色谱）,概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,色谱分离方法的分类,色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：吸附色谱 利用分配系数的不同分配色谱 利用物理吸附性能的差异离子交换色谱 利用离子交换原理凝胶色谱 利用排阻作用力的不同,图示,色谱法简单分类,色谱系统的基本组成,色谱分离的基本概念,分配系数可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度,保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小，As:固定相平均截面积，Am:流动相平均截面积,洗脱体积Ve色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,Vm:色谱柱中流动相体积，Vs色谱柱中固相体积,色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度理论塔板高度：L-柱长,吸附色谱,原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离， 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离关键要素：吸附剂和展开剂的选择吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,Adsorption chromatography,常用的吸附剂：氧化铝：有碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。 碱性氧化铝，混有碳酸钠等成分而带有碱性，对于分离一些碱性成分，如生物碱类，但是不宜用于醛、酮、酯、内酯等类型的化合物分离，因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。 中性氧化铝是由碱性氧化铝除去碱性杂质，冲洗至中性。仍属于碱性吸附剂的范畴，不适用于酸性成分的分离。 酸性氧化铝是氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理得到的产物，并使氧化铝颗粒表面带有 NO3-或 Cl-的阴离子，从而具有离子交换剂的性质，酸性氧化铝适合于酸性成分的柱色谱。 硅胶：酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的柱色谱。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，可因离子交换反应而吸附碱性化合物。硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量，分离范围广，能用于极性和非极性化合物的分离，,活性炭：是一种非极性吸附剂。柱色谱用的活性炭，最好选用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。 活性炭是非极性吸附剂，其吸附作用与硅胶和氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中较弱，因此水的洗脱能力最弱而有机溶剂较强。主要分离水溶性成分，如氨基酸、糖、苷等。 聚酰胺：为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。 聚酰胺对有机物质的吸附属于氢键吸附，通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离氨基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附的强弱则取决与各种化合物与之形成氢键缔合的能力。主要用于分离黄酮类、蒽醌类、酚类、有机酸类、鞣质类等成分。,展开剂的选择,展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果展开剂选择的原则：（1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小（2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力,常用展开剂的洗脱能力及极性比较,见书上242243,一般吸附色谱的操作程序,根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物,分配色谱,原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法要素：固定相、载体、流动相 固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定， 不与固定相和流动相发生化学反应分配色谱适合分离极性基团相同而非极性部分差异教大,或溶解度相差较大,或极性太强不适合吸附色谱分离的化合物分离机制：利用组分在流动相和固定相间溶解度差别进行分离,载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体种类：硅胶硅藻土纤维素葡聚糖凝胶,固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相展开剂的选择:选择各组分溶解度相差大的溶剂流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱） *反相色谱固定相是非极性的, 流动相是极性的,离子交换色谱,以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，分离机制：使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列,Expanded Bed,(分子筛)凝胶色谱,在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱优点：操作简便分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐分辨率低分离机制： 利用分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离,分子筛凝胶色谱原理,Desalting proteins,proteins,salts,凝胶色谱填料,葡聚糖凝胶Sephadex G-系列聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列琼脂糖凝胶Sepharose系列Superose系列,纸层析,是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析介质：滤纸操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹,展开剂的选择,展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2）展开方式：上行色谱，溶剂自下向上流动下行色谱，溶剂自上向下流动，该法适合性质相近组分的分离径向色谱显迹：可采用化学试剂显色，如氨基酸层析体系中常用茚三酮试剂显色,薄层色谱法,将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法常用的固定相有： 硅胶和氧化铝优点：设备简单、操作方便快速显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色灵敏度高（较纸层析）可以大量制备,HPLC,高效液相色谱,HPLC 分离原理,液固吸附色谱:按照极性大小顺序先后分离,非极性溶质先流出液液分配色谱:类似于液-液萃取,同分配色谱离子交换色谱:与离子交换中心的不同亲和力空间排斥色谱:类似于分子筛效应,小分子易渗透保留在凝胶内.,30m,15m,5m,反相液相色谱,液-液色谱有正相和反相之分。如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化合物。正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。另外，其他有些色谱如柱色谱也有正反相之分。 反相液相色谱分离多肽和蛋白质是基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求。通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性,载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m ） Hypersil Spherosil XOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 苯基流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃,为什么反相色谱应用广泛?,它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。,蛋白质分离常用的色谱方法,免疫亲和层析属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离免疫亲和层析介质的获得：（1）获得抗体（2）抗体连接到载体上,亲和色谱（Affinity chromatography）,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,Competitive elution,疏水层析（HIC）在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。操作要点:蛋白质的局部变性，盐浓度高疏水作用强，但高盐浓度下的选择性差洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行，一般采用有机溶剂或非离子型的洗涤剂。,Mechanism of HIC,离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点：由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定pHpI, 蛋白质带负电荷由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点）,