第五讲 蛋白质结构解析技术 （二） 1. 氨基酸序列分析 2. X-射线衍射技术 3. 核磁共振 4. 质谱技术 5. 结构分析的其它方法 现代光谱技术 三维电镜重构技术 动力学全局研究技术 主 要 内 容 第三节 核磁共振技术 Nuclear Magnetic Resonance 1.概述 2.原理 3.基本概念 4.核磁共振结构测定基本程序 5.适用范围及优缺点 一、概述一、概述 1、核磁共振 2、简单历史回顾 3、核磁共振仪器的进展 一、概述 1、核磁共振（Nuclear magnetic resonance, NMR） l在静磁场中，自旋的原子核发生能级（塞曼）分裂，特征能 量的电磁波引起原子核磁能级共振跃迁并吸收特征能量电磁 波的现象。称为“核磁共振”或“核移跃迁”。 l电磁波与磁场中的原子核作相互用，产生核磁共振。 lNMR属于吸收光谱，与UV-vis和红外光谱法类似。 核磁共振波谱学是光谱学的一个分支，处于电磁波的最低端 无线电波段。 是物质结构定性分析最强有力的工具之一，亦可 进行定量分析。 如：测定有机化合物的结构 1H NMR 分子中氢原子的位置、环境以及官能 团和C骨架上的H原子相对数。 CH CH2 CH3 中H的比值或相对数量 2、简单历史回顾 1946年 F. Bloch(斯坦福大学) (2)与外磁场相反，能量高， 磁量子数1/2; 发生核磁共振，就要吸收特征能量。 3、核磁共振条件 在外磁场（H0）中，原子核能级裂分。 射频振荡线圈产生电磁波， 产生与H0垂直的震荡磁场H1。 改变射频，其频率与自旋核的LarmorLarmor进动频率进动频率（ 0 0 ）相等时 核吸收射频波的能量，由低能级向高能级跃迁，即核磁共振 共振条件： 射频磁场的频率（ ） = = 0 0 = = HH 0 0 / /( (2 2 ) ) 如：H0=14092 Gs = H0 /(2 )=60 MHz = 0 = H0 /(2 ) 推论 l 若磁场固定， 频率（）值取决于磁旋比（） 值不同的核，在同一磁场中发生核跃迁的频率不同 如：1H和19F，H F， 1H需要比19F更大的射频才能发生共振 某一射频只能观察一种核的核磁共振（NMR） 若固定射频（ ），19F比1H需要更大的H0才能发生共振 4、弛豫过程 l？： 通过非辐射方式使高能态核回到低能态的过程，保持低能态核数始终 大于高能态核数，这个过程称。 l 弛豫过程的方式（2种）： （1）纵向弛豫（T1）（自旋-晶格）：高能级核将能量传递给周围的分子（固 体或液态），最终变为热运动，自旋核回到低能级的过程。 非碰撞传递，传递给回旋频率相等的物质。 T1：液态快，固体慢 （2）横向弛豫（T2）（自旋-自旋弛豫）：一个自旋核与另一个自旋核交换能 量的过程。各种能级的核数量不变，系统总能量不变。 T2：固体快、液态慢 （二）核磁共振波谱仪工作原理 1、工作原理 1永久磁铁： 提供外磁场，要求稳定性好 ，均匀，不均匀性小于六千万 分之一。外绕扫场线圈。 2 射频振荡器： 线圈垂直于外磁场，发 射一定频率的电磁辐射信 号。 如：60 MHz或100 MHz。 3 射频信号接受器（检 测器）：当质子的进动频 率与辐射频率相匹配时， 发生能级跃迁，吸收能量 ，在感应线圈中产生毫伏 级信号。 4样品管：外径5mm 玻璃管，测量过程中旋 转，磁场作用均匀。 2、实现核磁共振的两种方法 （1）扫场法: 不变，改变H0（常用） （2）扫频法: H0不变，改变 = 0 = H0 /(2 ) 3、样品的制备： 试样浓度：510%；需要纯样品1530 mg； 傅立叶变换核磁共振波谱仪需要纯样品1 mg ； 标样浓度（四甲基硅烷 TMS） ： 1%； 溶剂：1H谱四氯化碳，二硫化碳； 氘代溶剂：氯仿，丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物； 三、核磁共振与化学位移三、核磁共振与化学位移 l 化学位移的产生及表示方法 l 影响化学位移的因素 l 有机化合物化学位移简单介绍 1、化学位移的产生及表示方法 （1）化学位移 l化合物结构中不同位置的原子核，周围 的电子云密度不同，核磁共振的频率有 差异，即引起共振吸收峰的位移，这种 现象称为化学位移化学位移。 反映质子核所处的化学环境。 l 物质中所有质子核磁共振频率是否相同呢？ 共振条件可知： = 0 = H0 /(2 ) 强度一定的磁场中，H0=14092Gs 质子产生的核磁共振频率也一定，即为60MHz 则化合物中所有的质子处于一个吸收峰， 实际上并非如此，Why？ 1H NMR: CH3OH l质子化学位移不同的原因 分子中没有完全裸露孤立存在的质子 给定照射频率下，原子核外电子云产生感应磁场，与H0磁场方向相反， 对H0的磁场具有屏蔽作用屏蔽作用。 质子产生共振需要更大的外磁场强度（相对于裸露的氢核），来抵消屏 蔽影响。 l感生磁场强度与H0关系 感生磁场强度以屏蔽常数（ )表示，与H0成正比例关系， 电子云密度越大、屏蔽作用越大、 越大 质子核感受到的磁场强度将减小：H0(1-)： 核共振吸收的频率 与H0的关系： 0 = / (2 ) H0 (1- ) 屏蔽常数“” 反映电子云对质子的屏蔽作用 不同不同环境中的环境中的质子质子发生发生不同不同的化学位移的化学位移 （2） 化学位移表示方法 l 从吸收频率来看，“化学位移”的单位为“Hz” l 60 MHz仪器，质子共振频率变化约在1000 Hz Hz l 100 MHz仪器，质子共振频率的变化约在1700 HzHz l H0不同，共振产生的频率不同，无法比较。 l 要求测定几个Hz的精度，测定绝对值非常困难 l 因此，采用相对值的方法表示 “化学位移” （A）1970年 IUPAC（国际纯粹与应用化学协会）建议： l 化学位移用位移常数（）来表示，单位：ppm l 扫频： =（样品- 标准）106/ 标准 = （样品- 标准）106/ 仪器 l 扫场： =（H样品- H标准）106/ H标准 = （H样品- H标准）106/ H仪器 l 仪器：数十MHz到数百MHZ； l 测定差值：几十 Hz 至 几百 Hz l 比值：百万分之几，所以106 ，单位：ppm （2） 化学位移表示方法 （2）化学位移的表示方法 （B) 位移的标准 没有完全裸露的氢核， 没有绝对的标准。 相对标准： 四甲基硅烷 Si(CH3)4 ，简称：TMS，（内标或外标） 位移常数 TMS=0 （ 1970年 IUPAC 规定） (C) 为什么用TMS作为基准? a. 12个氢处于完全相同的化学环境，只产生一个尖峰； b. 屏蔽强烈，位移最大。与有机化合物中的质子峰不重迭； c. 化学惰性；易溶于有机溶剂；沸点低，易回收。 （2）位移的表示方法 与裸露的氢核相比，TMS的 化学位移最大，但规定 TMS=0， 其它种类氢核的位移为负值，负 号不加（省略）。 = = ( ( 样 样 - - TMSTMS)/ )/ TMS TMS 10 10 6 6 ( (ppmppm) ) 小，屏蔽作用强，共振 需要的磁场强度大，在高场出 现，图右侧； 大，屏蔽弱，共振需要 的磁场强度小，在低场出现， 图左侧； （D）表示规则 2、影响化学位移的因素（4个因素） （1）电负性去屏蔽效应 与质子相连元素的电负性越强 ，吸电子作用越强，价电子偏离质 子，屏蔽作用减弱，信号峰在低场 出现。 -CH3 =1.62.0，高场； -CH2I =3.0 3.5, 位移增大 -O-H， -C-H， 大 小 低场 高场 图1和图2 质子的化学位移有何不同？Why？ 图1 甲醇的1H NMR 图1 碘乙烷的1H NMR 电负性对化学位移的影响（了解） 碳杂化轨道电负性：SPSP2SP3 （2）磁各向异性效应 价电子产生诱导磁场， 质子位于其磁力线上，与外 磁场方向一致，对质子具有 去屏蔽。 （3）氢键效应 形成氢键后1H核屏蔽作用减少，氢键属于去屏蔽效应。 原子之间的相互作用力的变化 测定物质之间的相互作用 （4）空间效应 空间效应 Ha=3.92ppm Hb=3.55ppm Hc=0.88ppm Ha=4.68ppm Hb=2.40ppm Hc=1.10ppm 去屏蔽效应 3、化合物的化学位移简单介绍 饱和烃 -CH3: CH3=0.791.10ppm -CH2: CH2 =0.981.54ppm -CH: CH= CH3 +(0.5 0.6)ppm H=3.24.0ppm H=2.23.2ppm H=1.8ppm H=2.1ppm H=23ppm 烯烃 端烯质子：H=4.85.0ppm 内烯质子：H=5.15.7ppm 与烯基，芳基共轭：H=47ppm 芳香烃 芳烃质子：H=6.58.0ppm 供电子基团取代-OR，-NR2 时：H=6.57.0ppm 吸电子基团取代-COCH3，-CN，-NO2 时：H=7.28.0ppm -COOH：H=1013ppm -OH： （醇）H=1.06.0ppm （酚）H=412ppm -NH2：（脂肪）H=0.43.5ppm （芳香）H=2.94.8ppm （酰胺）H=9.010.2ppm -CHO：H=910ppm 常见结构单元化学位移范围 四、自旋偶合与自旋分裂四、自旋偶合与自旋分裂 1、峰的裂分现象 l乙醚的谱图（低分辨）， l高分辨现代核磁共振仪， l1H两个峰各分裂成四重峰和三重峰， l这种情况叫做峰的裂分现象。 低分辨NMR 高分辨NMR CH3-CH2-O-CH2-CH3 2、自旋偶合与自旋裂分 每类氢核不总表现为 单峰，有时为多重峰。 原因： 相邻两个C原子氢核之间 的自旋偶合（自旋干扰）； l自旋偶合：相邻两个C原子氢核自旋产生磁场的相互作用， （自旋原子核之间产生的相互干扰） 称自旋-自旋耦合（spin-spin coupling），简称自旋耦合。 l自旋分裂：由于自旋原子核产生磁场之间的干扰， 原子核的NMR共振信号发生分裂的现象。 例如：一个质子信号的分裂取决于邻近C原子上的质子数目。 l自旋偶合产生共振信号的裂分； l自旋偶合是因，峰的裂分是果 等性的H： ：CH3的三个H,不发生自旋耦合 3、自旋偶合 4、峰裂分数与峰面积 峰裂分数：符合n+1 规律； l主要由相邻碳原子上的质子数决定； l 各峰的系数符合二项式展开式的系数； 峰面积：峰面积的积 分与同类质子数成正比， 仅能确定各类质子之间的 相对比例。 峰裂分数 1:1 1:3:3:1 1:1 1:2:1 峰裂分数 1H核与n个不等价1H核相邻时，裂分峰数： （n+1)( n+1)个； (nb+1)(nc+1)(nd+1)=22 2=8 Ha裂分为8重峰 1:3:3:11:2:1 1:1 1:6:15:20:15:6:1 峰裂分数Ha裂分为多少重峰？ 01234 Jca Jba Jca Jba Ha裂分峰:(3+1)(2+1)=12 实际Ha裂分峰:(5+1)=6 强度比近似为：1:5:10:10:5:1 5、偶合常数 （J） （1）定义： l 相邻两个裂分峰之间的距离称为偶合常数(J)， l 其单位为Hz。 l用来衡量偶合作用的大小。 （2）裂分峰的化学位移 l奇数峰居中 l偶数峰也居中 （3）耦合常数性质 表示两个质子间相互干扰的强度。Jab的大小与磁场H0 的强度无关，是由偶合分子本身结构决定。