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院(系、部) 化学与生物工程学院 专业 生物技术(师范) 年级13级 学号17130208 姓名 组别 第二组 课程名称 植物细胞工程学 实验日期 2016.3-6 指导老师 实验名称 植物组织培养综合实验 一、 实验目的1. 熟悉MS培养基的组成,掌握贮备液的配制方法2. 学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法;3. 掌握超净工作台上的接种方法与注意事项,了解接种室的灭菌方法;4. 了解组织培养的基本程序;5. 掌握接种的方法和材料的培养过程;6. 掌握无菌操作技术,包括外植体除菌和接种技术;7. 观察外植体的生长状况、染菌状况,剔除染菌外植体;8. 了解MS培养基和1/2MS培养基的区别二、 实验原理1. 植物细胞的全能性一切植物都由细胞构成,细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。植物细胞含有全套遗传信息,具有形成完整植物的潜能。2. 植物细胞表现出全能性的条件1. 离体状态;2. 有一定的营养物质,激素和其他外界条件(无菌、温度、pH);3. 选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型3. 无菌条件把植物的组织、器官等,使其在人工控制的无菌条件下,使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的,在接种前必须进行表面消毒,这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的,所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。4. 脱分化与愈伤组织已有特定结构与功能的植物组织,在一定条件下,其细胞被诱导改变原来的发育途径,逐步逆转其原有的分化形态,转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。5. 培养基植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固,琼脂本身并不提供任何营养,它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来,仅溶解于热水,成为溶胶,冷却后(40以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在410克升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力,存放时间过久,琼脂变褐,也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基,特点是:无机盐浓度较高,元素间的比例适当,离子平衡性好,具有较强的缓冲性,因而在培养的过程中可维持较好的稳定性;营养丰富,在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分;微量元素种类全,浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。6. 生长调节物质包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。一般来说,基本培养基只能保证培养物的生存,维持其最低的生理活动,而只有植物激素的配合使用,才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。1) 生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长,有利于外植体脱分化并启动细胞分裂,有利于形成愈伤组织。同时生长素和细胞分裂素的协调作用,对于培养物的形态建立十分必要。在离体培养的分化调节中,生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。在液体培养中,生长素还有利于体细胞胚胎发生。常用的生长素有吲哚乙酸(IAA)、奈乙酸(NAA)、二氯苯氧乙酸(2,4-D)和吲哚丁酸(IBA)等。在使用2,4-D时,必须严格控制使用浓度和培养时期,因为高浓度的2,4-D常常抑制器官的发生,在分化培养时不能使用2,4-D代替其他生长素。2) 细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂,调节器官分化,延迟组织衰老,增强蛋白质合成等。此外,它还能显著改善其他激素。离体培养中,细胞分裂素能够促进不定芽的发生,与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、异戊烯氨基嘌呤(2ip)、玉米素(ZT)等。3) 赤霉素(GA)是一类广泛存在于植物体内的激素,目前已发现的天然赤霉素有20多种。自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。在离体培养条件下,赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长,与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响,同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。三、 实验材料、试剂和仪器设备1. 植物材料:马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体(盘龙参、波斯菊、金叶女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季)2. 实验药品(试剂):甲醛、MS培养基母液(见表1)、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精(75%和90%)、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水;3. 仪器设备和实验用具:高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。四、 实验步骤(一) 培养基母液的配制(2016/3/4)1. MS培养基贮备液配制贮备液I(g)(20)贮备液III(mg) (100)MgSO47H2O3.70500mLFeSO47H2O 278 100mLNH4NO316.50Na2EDTA2H2O 373 CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.006-BA50mg50mLKH2PO41.70NAA50mg贮备液II(mg) )(100)贮备液IV(mg) )(100)KI 8.3 100mL肌醇 1000 100mLH3BO3 62 烟酸 5 MnSO44H2O 223 盐酸硫胺素 1 ZnSO47H2O 86 盐酸吡哆醇 5 Na2MoO42H2O 2.5 甘氨酸 20CuSO45H2O 0. 25 称量 溶解 混合 定容CoCl26H2O 0. 25 表11) 每种母液中的几种成分称量完毕后,分别用少量的蒸馏水彻底溶解,然后再将它们混溶,定容。2) 贮备液III需加热溶解。混合后调至pH5.5,定容,保存在棕色玻璃瓶内。3) 6-BA:1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容)。NAA:1 mg/mL(先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容)。4) 各种母液配制完成后,分别用玻璃瓶贮存,贴上标签,注明母液号、配制倍数、日期等,放入冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上,有机物质的母液保存时间在半年以内,但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。2. 其他试剂的配置1) 1 mol/L 的NaOH:1瓶2) 1 mol/LHCL :1瓶3) 0.1%的升汞或2%次氯酸钠:每个超净工作台一瓶(用时处理5-30min)4) 7075%酒精:每个超净工作台一瓶5) 95%酒精:每个超净工作台一瓶6) 75%酒精棉球:每个超净工作台一瓶(二) 培养基的配制与灭菌1. 培养基配制1) 配制培养液(MS培养液):按每次配制500 mL培养基计,用量筒或者移液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、各5 mL;2) 溶化琼脂:用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸中,加入蒸馏水400 mL,用用电炉加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中,最后加蒸馏水定容至500 mL,搅拌均匀。3) 调pH:用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH,一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。4) 培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时,先将培养基倒入烧杯中,然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。组培瓶中培养基的量约50 mL 。每500 mL培养基,可分装1015瓶。5) 培养基分装完毕后,应及时封盖瓶口。最后在组培瓶外壁贴上标签。2. 培养基灭菌(高压灭菌)1) 放培养瓶。将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中,再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐,可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。2) 放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内,如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口),用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。3) 待需要灭菌的物品码放完毕,盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下,灭菌20 min。灭菌后取出培养瓶,让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。3. 其他灭菌1) 不耐热的物质将采用过滤灭菌 如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。 过滤灭菌的原理:溶液通过滤膜后,细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。2) 玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌 即利用烘箱加热到160-180 的温度来杀灭微生物。3) 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌(三) 接种室和超净工作台的灭菌处理1. 接种室熏蒸灭菌长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法:甲醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算,高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后,把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸,以利清洗),然后将甲醛也倒入碗或杯内,立即出屋关门。几秒钟后,甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂,当它与一部分甲醛作用时,由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行,熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此,可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水,倒在另一个烧杯里,迅速放入熏蒸室内,使甲醛和氨水发生中和反应,以消除甲醛味,减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。对有材料的培养室,也可以采用乙二醇加热熏蒸2. 准备组培室将组培室打扫干净,调至适宜温度3. 超净工作台处理1) 材料准备用75%酒精擦拭,准备好超净工作台内物品,包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等2) 灭菌处理实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面,然后开启紫外灯,紫外照射20min-30min。关闭紫外灯,开启风机10min后打开日光灯。用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯,将金属器械在其火焰上灼烧,冷却待用。注意:所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧,以防退火。移液管不能灼烧,培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。(四) 无菌苗的培养(2016/3/11)1. 培养基配制(方法同(二)培养基的配制与灭菌)种子的萌发采用1/2MS培养基1/2MS培养基贮备液贮备液贮备液贮备液蔗糖琼脂12.5mL2.5mL2.5mL2.5m
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