复旦大学 博士学位论文 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 姓名：崔杰峰 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：刘银坤 20040428 博士论史 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质纰学研究 中文摘要 转移复发是影响H C C 术后生存的最大障碍。转移复发的发生与癌细胞的生物 学行为( 黏附、运动、增殖) 、细胞外基质、机体免疫与肿瘤血管生成等许多因 素有关。比较蛋白质组学作为多基因、多因素复杂病理机制研究的有效手段，可 高通量，大规模地筛检在疾病发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子，运用该 研究策略，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物，新关键分子，极大地 丰富诊断标志物的选择组合及复杂致病机理的全面阐明。本研究通过对转移潜能 高、低的人肝癌细胞系( M H c c 9 7 H M H c c 9 7 L ) 和不转移人肝癌细胞系( H e p 3 B ) 的 全蛋白质组表达谱差异分析，筛出一些有潜在应用价值的差异蛋白，同时采用反 义核酸技术和与侵袭生物学特性有关的鉴定方法对差异蛋白a n n e x i n l 和S I O O A 4 进行了功能分析和验证。 第一部分 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学分析 本部分工作的主要目的：( 1 ) 优化双向凝胶电泳( 2 - D E ) 相关技术，建立相 对稳定、适合本实验室的标准技术平台。( 2 ) 运用优化后的2 一D E 结合液相色谱 一电喷雾一串联质谱( L C E S I M S M S ) 技术，对转移潜能不同人肝癌细胞系中全蛋 白质差异表达谱进行分析，筛查在转移过程中发挥重要作用的差异蛋白质分子。 2 一D E 技术是比较蛋白质组学研究的重要支撑技术之一，在比较蛋白质组学 分析中，它所起的作用主要是对复杂蛋白质样品进行分离并显示差异蛋白的数量 和位置。保持2 一D E 技术的稳定标准是比较蛋白质组学成功的关键。我们针对影 响2 - D E 蛋白质图谱质量较大的环节，如上样方式( 杯上样、溶涨上样) 、银染方 法( 双胺银染法和非双胺化学显色银染法，固定时间) 、细胞裂解液组成( 离液 剂浓度) 分别进行了优化比较分析。结果发现同一细胞系M H C C 9 7 L 采用杯上样、 双胺银染法获得的平均蛋白斑点数为1 0 9 2 + 4 0 个( n = 3 ) ，明显多于溶涨上样、非 双胺化学显色银染获得的平均蛋白斑点数7 8 4 + 1 4 个( n = 3 ) 。非双胺化学显色银 染的图谱背景明显深于双胺银染结果，杯上样的碱性区、酸性区蛋白质分离效果 明显优于溶涨上样。由于采用双胺银染法获得的蛋白斑点数远多于非双胺化学显 色银染，前者胶中表达弱的点在后者胶中有匹配，说明双胺银染法敏感性优于非 双胺化学显色银染法。与溶涨上样相比，杯上样可显著提高碱性区、酸性区蛋白 质分离效果。 同一L 0 2 细胞系经含不同浓度离液剂的细胞裂解液处理，平均获得的蛋白斑 点数差异较大，分别为9 2 5 + 1 1 个( 7 M 尿素+ 2 M 硫脲，n = 3 ) ，1 0 1 9 5 1 3 5 个( 9 M 博士论文人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 尿素，n = 3 ) 7 8 1 一+ 3 4 个( 8 M 尿素，n ：3 ) 。上述结果表明离液剂浓度改变对蛋白斑 点的获得影响较大。 不同固定时间( 双胺银染法) 影响蛋白质条带的显示，固定方式A ( 4 0 乙醇 1 0 乙酸固定1 h ，后5 乙醇5 乙酸固定过夜) 条带显示最多；固定方式B ( 4 0 乙醇1 0 乙酸固定l h 。) 条带显示次之；固定方式C ( 5 乙醇5 乙酸固定过夜) 条带显示最少。固定方式A 得到的蛋白质银染图谱理想，建议用于蛋白成分复杂 图谱的显示。 3 种转移潜能不同人肝癌细胞系的蛋白质样品，在相同条件下分别进行3 次 双向电泳，H e p 3 B 平均检测到9 7 6 + 1 1 2 个蛋白点( n = 3 ) ，M H C C 9 7 L 平均检测到 1 0 9 2 + 4 0 个蛋白点( n = 3 ) ，M H C C 9 7 H 平均检测到8 8 8 + 1 5 个蛋白点( n = 3 ) ，以其中 点数最多的一块M H C C 9 7 L 图谱作为参考胶，H e p 3 B 与其匹配的平均匹配点数为 6 3 7 + 3 7 个( n = 3 ) ，M H C C 9 7 L 与其匹配的平均匹配点数为7 7 1 + 1 6 个( n = 2 ) ，M H C C 9 7 H 与其匹配的平均匹配点数为5 8 9 + 5 1 个( n = 3 ) ，平均匹配率分别为6 5 7 ，7 2 1 ， 6 6 2 。不同胶间蛋白质斑点的位置偏差I E F ( 等电聚焦) 方向为2 9 5 + 0 9 5 m m ， S D S P A G E 方向为2 8 7 + 0 。8 8 m m 。H e p 3 B 、M H C C 9 7 L 、M H C C 9 7 H 中有3 5 9 个蛋白质点 匹配。与H e p 3 B 比，M H C C 9 7 L 有1 0 3 个点未匹配，相差1 0 倍以上的上调点有5 7 个，相差1 0 倍以上的下调点有4 9 个；M H C C 9 7 H 有1 1 3 个点未匹配，相差1 0 倍 以上的上调点有4 7 个，相差1 0 倍以上的下调点有5 2 个。质谱鉴定出S I O O A 4 ， S I O O A 6 ，S I O O A l l ，a n n e x i n1 等2 6 种胶内差异蛋白质。部分差异蛋白如a n n e x i n l 和$ 1 0 0 A 4 等在转移与不转移人肝癌细胞系中为最新发现。由于转移性肝癌细胞 系全蛋白质表达谱与不转移人肝癌细胞系比差异明显，推测肝癌侵袭转移性与细 胞内多种差异蛋白的改变相关。 第二部分转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白的 再验证及功能分析 对差异蛋白a n n e x i n l 和$ 1 0 0 A 4 的功能解析是本研究的另一个重要目标。由 于两种差异蛋白是从转移与不转移的人肝癌细胞系蛋白质表达谱的差异比较中 筛选出来的，因此一系列与侵袭转移有关的细胞生物学功能的检测成为课题的重 点。 为保证差异蛋白初筛结果的可信及下游分析的确定性，我们首先对差异蛋白 结果进行了再验证，应用R T P C R ，W e s t e r nb l o t ，细胞免疫化学证实a n n e x i n l 和8 1 0 0 A 4 的确在有转移潜能人肝癌细胞系( M H C C 9 7 H 和M H C C 9 7 L ) 中高表达。 采用反义R N A 技术策略，分别构建p c D N A 3 1 ( + ) A Sa n n e x i n l 表达质粒和 博士论文 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 p c D N A 3 1 ( + ) A S $ 1 0 0 A 4 表达质粒。转染高转移潜能人肝癌细胞系M H C C 9 7 H ，观 察a n n e x i n l 和S I O O A 4 蛋白表达降低对M H C C 9 7 H 细胞生物学行为( 包括运动、侵 袭、M M P s 分泌、凋亡等) 的影响。 侵袭实验显示穿过人工基底膜细胞数分别为：5 0 + 1 4 1 4 ( M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) A SS I O O A 4 ) ，1 6 4 3 + 2 2 2 5 ( M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) A Sa n n e x i n l ) ， 1 6 4 一+ 1 5 7 4 ( M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) ) ，1 6 8 6 + 1 5 1 7 ( M H C C 9 7 H ) ，转染 p c D N A 3 1 ( + ) A SS I O O A 4 质粒的M H C C 9 7 H 细胞穿过人工基底膜数目明显少于未转 染和转染空质粒( t 检验，P O 0 5 ) o rp c D N A 3 1 ( + ) A Sa n n e x i n l ( tt e s t ，P O 0 5 ) S u c hb i o l o g i c a lb e h a v i o rc h a n g e si n 姗C C 9 7 H w i t h d o w n r e g u l a t i o np r o t e i ne x p r e s s i o n o fS l O O A 4a n da n n e x i n l b y a n t i s e n s eR N Ai n d i c a t e dt h a tS 1 0 0 A 4m a yb ea ni m p o r t a n tc o n t r i b u t ei nH C C c e l l1 i n e si n v a s i o na n dm e t a s t a s i Sp o t e n t i a l ，b u ta n n e x i n lo n l yi n f l u e n c e d t h em o t i l ep r o p e r t i e so fH C Cc e l l1 i n e s T r a n s f e c t e dc e l la p o p t o s i sr a t i o nw a s9 9 5 ( M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) A S S I O O A 4 ) ，2 2 2 ( M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) A Sa n n e x i n l ) ，6 4 4 ( M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) ) ，6 9 7 ( M H C C 9 7 H ) r e s p e c t i v e l Yb yF C Ma n a l y s i S T h es i g n i f i c a n t c h a n g e si na p o p t o s i So fM H C C 9 7 Ht r a n s f e c t e dw i t hp c D N A 3 1 ( + ) A Sa n n e x i n l i m p l i e da n n e x i n lw a si n v o l v e di na p o p t o s i S T h en u m b e ro ft r a n s f e c t e dc e l li ne a c h p h a s ed u r i n g c e l l c y c l e s d i s p l a y e d8 0 5 7 6 3 4 7 8 8 8 7 9 5 ( G O G 1 p h a s e ) ，9 6 9 1 4 4 博士论文人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 1 0 9 6 1 3 2 6 ( Sp h a s e ) ，9 8 1 9 2 6 1 0 1 6 7 2 5 ( G 2 一M p h a s e ) a c c o r d i n gt h eo r d e ro fM H C C 9 7 H ，M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) ，M H C C 9 7 H p c D N A 3 1 ( + ) A SS I O O A 4 ，M H C C 9 7 H