工业微生物实验指导书 邓年方编 贺州学院生物技术实验室 2008年5月 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 1 目录 实验一 用阿须贝氏培养基分离好氧性自生固氮菌.2 实验二 从泡菜中分离乳酸菌.3 实验三 水中细菌总数的测定.4 实验四 酸奶的制作.5 实验五 甜酒酿的制作.6 实验六 乙醇发酵实验.7 实验七 单细胞蛋白的生产.10 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 2 实验一 用阿须贝氏培养基分离好氧性自生固氮菌 一、实验目的 1通过对好氧性自生固氮菌的分离，加深理解选择性培养的原理和应用。 2熟悉从自然样品中分离微生物的具体操作方法。 二、实验原理 选择性培养是一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养，具有使混合菌中的劣势发展成优势菌的功能，故被广泛用于菌种筛选等领域。阿须贝氏（Ashby）无氮培养基是一种缺之结合态无机或有机氮源的培养基，可有效从土壤中分离自生固氮菌。其选择的原理是自生固氮菌在保证碳源（甘露醇或葡萄糖）和无机营养供应的情况下，可利用空气中的游离氮合成自身需要的含氮有机物，而其他各类微生物多无自生固氮能力，因此达到了选择性富集的效果。 三、实验材料和器皿 1. 培养基：阿须贝氏无氮培养基 甘露醇10g，KH2PO4 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 0.1g，CaCO3 5g， 蒸馏水1000ml，琼脂粉8g，pH7.27.4。 2. 器皿：无菌培养皿，无菌吸管，研钵，接种环，三角瓶，载玻片等。 3. 其他：表土样本，无菌水等。 四、实验方法 1. 采集土样：用小铲铲取稍干的10cm深和20cm深的土壤样品约1克，适当研碎； 2. 准备平板：将阿须贝氏培养基加热融化，待冷至50左右倒数个平板，冷却待用； 3. 纸板布土：将土样倒在约 15cm15cm 大小的毛面硬纸板上，摇动几下，轻轻倒去颗粒较大的土样； 4. 弹土接种：把纸板沾土的面朝向平板并盖上,随即用手轻轻弹数下.然后移去纸盖上皿盖； PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 3 5. 保温培养：将培养皿平板倒置后放入28恒温中培养4-7d； 6. 观察菌落：凡出现大型、黏稠、半透明，颜色呈白色、褐色或黑褐色的菌落，一般都是好氧性固氮菌。 7. 分离纯种：可用平板划线分离法进行菌种纯化。 实验二 从泡菜中分离乳酸菌 一、实验目的 掌握从泡菜中分离有关乳酸菌的方法。 二、实验原理 乳酸菌都是一些兼厌氧菌，革兰氏阳性，杆状或球状，无芽孢，不运动，分解和合成能力较差，营养要求较高，需提供丰富的肽类、氨基酸和维生素，它们缺乏呼吸链成分、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，在琼脂培养基表面或内层只形成较小的白色或淡色菌落。常用的分离培养基有番茄汁碳酸钙琼脂培养基、麦芽汁碳酸钙琼脂培养基。分离方法有平板划线法或经适当稀释后进行涂布平板法。 三、实验材料和器皿 1. 培养基：番茄汁碳酸钙琼脂培养基 葡萄糖 10g，酵母膏 7.5g，KH2PO42g，吐温 800.5ml，琼脂 20g，番茄汁100ml，自来水900ml，Ph7.0。 2. 器皿：无菌培养皿，无菌吸管，研钵，接种环，三角瓶，载玻片等。 3. 其他：泡菜汁，无菌水等。 四、实验方法 1. 配制番茄汁碳酸钙琼脂培养基，倒平皿，凝固后待用； 2. 平板分离：将优质的泡菜汁通过直接平板划线法或经适当稀释后进行涂布平板法分离出单菌落； 3. 恒温培养：将上述平板分别放入25 、37温箱培养48h以上也可放入PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 4 厌氧罐内培养； 4. 观察菌落：乳酸菌在上述平板培养基表面只形成浅色（一般为淡黄或白色）的小菌落； 5. 移种保存：将菌落接入斜面试管，经培养后作保存用。 实验三 水中细菌总数的测定 一、实验目的 1. 学习并掌握水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。 2. 了解水质状况与细菌数量在饮水中的重要性。 二、实验原理 水中细菌总数测定是测定水中需氧菌、兼性厌氧菌和异养菌的总数。水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志，细菌数量越多，则水中有机质含量越大。本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。以1ml水样在营养琼脂培养基中，于37培养24h后所生长的细菌菌落的总数，作为水体受细菌污染程度的标志，我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。 三、实验材料与器皿 1. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 称取3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、7g琼脂，加入到1L蒸馏水中，加热、搅拌使之溶解，用盐酸和氢氧化钠将溶液pH值调节为7.07.2。 2. 器皿： 无菌三角瓶，无菌的带玻璃塞瓶，无菌培养皿，无菌移液管，无菌试管等。 3. 实验材料：自来水 四、实验方法 1. 水样的采集与保藏 自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，然后再放水5-10min，最后用无菌容器接取水样，并速送回实验室检测。 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 5 2. 水中细菌总数测定 自来水：用无菌移液管吸取1ml水样，加入无菌培养皿中（每个水样重复3个培养皿），然后在每个上述培养皿内各加入约15ml已融化并冷却至45-50的 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并轻轻旋转摇动，使水样与培养基充分混匀，冷凝后即成检测平板。然后将其倒置于37恒温箱内培养24h。 3. 计菌落数 将培养24h的平板取出，用肉眼观察，计平板上的细菌菌落数（计数时，对那些看来相似、距离很近但不相触的菌落，应一一计数。那些紧密接触而外观相异的菌落，也一一计数。）。 实验四 酸奶的制作 一、实验目的 学习自制酸奶的方法。 二、实验原理 酸奶又称酸乳，是以牛奶为要原料，经乳酸菌发酵而制成的一种营养丰富、风味独特的保健饮料。用于酸奶发酵的乳酸菌主要是德氏乳杆菌保加利亚亚种，和唾液链球菌嗜热亚种，在有些酸奶中还使用另一些乳酸菌，例如嗜酸乳杆菌事乳酸菌乳脂亚种，（旧称乳脂链球菌）等。酸奶发酵中主要的生物变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其 H 降至酪蛋的等电点 4.6 附近 4.04.6从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酪蛋白降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二铜等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。 三、实验材料与器皿 1.实验材料：德氏乳杆菌保加利亚亚种，嗜热链球菌（均来源于买来的酸奶中，因为酸奶中含有大量活乳酸菌），奶粉，白糖 2.器皿：无菌瓶，培养箱，冰箱等 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 6 四、实验方法 1.配奶：用奶粉按1：7比例加水配成还原奶，然后在牛奶中添加 6%-10%白糖后搅匀，并置于85-90消毒15min； 2.冷却：将消毒后的牛奶冷却至45左右； 3.接种：按5%10%比例将市售优质酸奶作菌种接入冷却牛奶上充分搅匀； 4.保温发酵：将接种后的牛奶置于4042的温箱中保有温34h（具体时间视凝乳速度而定） 5.后熟：己形成凝胶态的酸奶放在4 左右的低温下保持1224h，以便其后熟； 6.品味：评定酸乳质量有理化指标和微生物学指标两类。本实验中产品的质量以品尝时有良好的口感和风味为主，同时观察产口的外观，包括凝块状态、色泽洁的度、表层光洁度、无气泡和具有悦人香味等。相反，若品尝时发现有异味则说明发酵中污染了杂菌。 实验五 甜酒酿的制作 一、实验目的 学会甜酒酿的制作技术。 二、实验原理 甜酒酿简称酒酿，是我国民间广泛食用的一种高糖、低洒精含量的发酵食品。由优质大米糯米经小曲中的根霉和酵母的糖化和发酵制成的。甜酒酿的制作原理十分简单：根霉的孢子在米饭基质上发芽后，迅速萌发出大量菌丝体，它们分泌的几种淀粉酶将基质中的淀粉水解为葡萄糖。这就是糖化阶段。接着，再由根霉和多种酵母菌继续将其中一部分葡萄糖转化为乙醇，此即酒精发酵阶段。一般优质的甜酒酿要求甜味浓郁、酒味清淡、香味宜人、固液分明。 三 、实验材料与器皿 1 实验材料：市售“甜酒药”、“白药”等小曲或“浓缩甜酒药”；优质糯米 2仪器及器皿：培养箱、高压锅、烧杯等 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 7 四、实验方法 1选好米料：选择优质糯米作发酵原料； 2淘净浸透：糯米用清水淘净后浸泡1224h； 3蒸煮熟透：用蒸笼或高压锅隔水蒸透糯米； 4降温接种：将蒸熟的米饭从蒸锅中取出、分散、降温。按量先将球状酒药在研钵中研细，然后再与量的米饭拌匀； 5装料发酵：接种后米饭可装入 500ml 烧杯中（经压实后容积在 300ml 左右），中央再留一散热和积液孔道。若用陶坛或其它容器也可，但事先都应洗净和开水淋泡，以防杂菌污染； 6保温发酵：在30 温箱中先培养2d左右。第一天可在米饭表面见到纵横交错的大量菌比体在延伸，接着可见米饭的黏度逐渐下降，糖化液慢慢溢出；至第二天，菌丝体生长与发酵继续进行。这时若发现米醅较干时，可适当补加些凉开水； 7后熟发酵：酿制2d后的酒酿己初步成熟，但口味不佳，因些须在810 较低温度下放置数天，进行后发酵，以减少酸味、提高糖度和酒香味； 8质量评估：优质的甜酒酿应是色泽洁白、米粒分明、酒香浓郁、醪液充盈、甜醇爽口的发酵食品。 实验六 乙醇发酵实验 一、实验目的 1、熟识酵母菌的扩大培养技术 2、掌握淀粉质原料发酵的技术。 3、学会测定乙醇发酵力的方法。 二、实验原理 在无氧条件下，酵母菌利用己糖发酵生成乙醇和CO2的作用，称为乙醇发酵。目前乙醇发酵所采用的微生物主要是酵母菌。生产上所使用的酵母菌原菌一般是固体斜面试管菌种，由于起酵母数量太少，不够生产之需，所以必须将斜面菌种PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 www.fineprint.cn 8 进行若干次的扩大培养，以获得含有足够数量酵母菌的酵母培养物（