细胞生物学实验方法与原理细胞生物学实验方法与原理 细胞信号转导研究技术细胞信号转导研究技术 周荣斌周荣斌 Contact Email：zrb1980 School of Life Sciences, USTC 1 细胞将外源和内源性变化转化成特定的信号并逐级传递，最终作出 相应的反应这是一个非常复杂且极为精细的调控过程它伴随着配体配体相应的反应，这是个非常复杂且极为精细的调控过程，它伴随着配体配体 与受体结合与受体结合、蛋白质的结构与活性改变蛋白质的结构与活性改变以及各种基因表达的变化各种基因表达的变化等。这 一过程依赖的分子组成的信号转导链称为“信号转导通路信号转导通路”细胞中不一过程依赖的分子组成的信号转导链称为信号转导通路信号转导通路”，细胞中不 同的信号转导通路交互作用、互相调控形成一个动态的信号转导网络。 随着生命科学的发展新的信号调节分子和信号转导机制不断被揭示随着生命科学的发展，新的信号调节分子和信号转导机制不断被揭示， 对信号转导网络的理解和绘制也逐步清晰。 细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激，经复杂的 细胞内信号转导系统的转换来影响细胞的生物学功能，这一过程称为 细胞信号转导细胞信号转导 2 细胞信号转导细胞信号转导 信号信号 细胞信号转导组成 受体受体 能接收信号的特定受体 受体后的信号转导通路 信号的生物学效应 信号转导级联通信号转导级联通路路信号转导级联通信号转导级联通 细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因） 蛋白质表达谱蛋白质表达谱蛋白质表达谱蛋白质表达谱 生物学效应生物学效应生物学效应生物学效应 3 配体检测配体检测 可溶性配体检测方法可溶性配体检测方法 S培养上清血液体液 可溶性配体检测方法可溶性配体检测方法 ELISA：培养上清、血液、体液 PCR：组织PCR：组织 Western；组织、上清等 质谱：组织、上清 流式细胞术：胞内 免疫荧光：组织、胞内 4 膜型配体检测方法膜型配体检测方法膜型配体检测方法膜型配体检测方法 PCR Western 质谱 流式细胞术流式细胞术 免疫荧光免疫荧光 5 细胞信号转导细胞信号转导 信号信号 受体受体 受体分离：密度梯度离心 受体定量：WB、Realtime PCR 受体定位：免疫组化免疫荧光 信号转导级联通信号转导级联通路路 受体定位：免疫组化、免疫荧光 受体功能：WB、免疫组化、RNAi、基因改造动物 信号转导级联通信号转导级联通 细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因） 蛋白质表达谱蛋白质表达谱蛋白质表达谱蛋白质表达谱 生物学效应生物学效应生物学效应生物学效应 6 实时定量实时定量PCR技术技术 （l tiPCR） 受体检测：定量受体检测：定量 实时定量实时定量PCR技术技术 （realtime PCR） 是在反应过程中实时检测与测 量DNA扩增产物的技术。 最常用的Sybr green法是PCR反 应中的SYBR Green荧光染料结合 所有的双链DNA产物每循环测所有的双链DNA产物，每循环测 量一次，荧光强度反应目的基因 扩增产物的量。 7 蛋白质印迹 （蛋白质印迹 （Western Blot） 受体检测：定量受体检测：定量 广泛用于分析样品中特异蛋白质的 技术。 以电泳方式将蛋白质按多肽的分子 质量大小分开，然后将电泳胶中的蛋 白质转移到NC膜或聚PVDF膜上，通过白质转移到NC膜或聚PVDF膜上，通过 抗体杂交膜上的蛋白质来检测靶蛋白。 与蛋白质结合的抗体再通过辣根过氧 化物酶进行显色定量化物酶进行显色定量。 8 免疫组化与免疫荧光技术免疫组化与免疫荧光技术 受体检测：定位受体检测：定位 免疫组化与免疫荧光技术免疫组化与免疫荧光技术 用对应受体的特异性标记的抗体或配体与受体结合，再通过标 记荧光或携带酶标的二抗产生信号，在荧光或普通显微镜下确 定受体的位置及其含量。可以直观分析受体的分布与变化。 9 受体检测：定位受体检测：定位 10 受体功能分析受体功能分析 基因沉默技术：RNAi/Knockout Agonist刺激： Inhibitor 11 细胞信号转导细胞信号转导 信号信号 化学修饰化学修饰 可逆磷酸化 受体受体 可逆磷酸化 泛素化与去泛素化 乙酰化与去乙酰化 Sumo化 信号转导级联通信号转导级联通路路 Sumo化 甲基化与去甲基化 亚细胞定位改变亚细胞定位改变 影像技术 信号转导级联通信号转导级联通 细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因） 影像技术 蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质相互作用 Western(广谱化磷酸化检 细胞核（转录因子基因）细胞核（转录因子基因） 蛋白质表达谱蛋白质表达谱 测和特异性蛋白检测) 免疫共沉淀IP ELISA 蛋白质表达谱蛋白质表达谱 生物学效应生物学效应 酵母双杂交 激酶分析法 显性负性突变体 生物学效应生物学效应 显性负性突变体 小分子抑制物 新技术新方法新技术新方法 12 信号通路检测：化学修饰信号通路检测：化学修饰 修饰功能检测修饰功能检测 质谱质谱 磷酸化细胞内信号转导磷酸化细胞内信号转导 质谱质谱 放射性测量分析放射性测量分析 磷酸化特异抗体的免疫印迹磷酸化特异抗体的免疫印迹磷酸化特异抗体的免疫印迹磷酸化特异抗体的免疫印迹 泛素化蛋白质降解泛素化蛋白质降解 质谱质谱 泛素化检测泛素化检测泛素化检测泛素化检测 乙酰化乙酰化 甲甲基基化化 转录的调控转录的调控 染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀 ChIPonchip甲甲化化p 糖基化细胞外信号转导糖基化细胞外信号转导 质谱质谱 高效液相色谱法高效液相色谱法 13 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 蛋白质磷酸化： 由蛋白质激酶催化的把ATP 的磷酸基转移到底物蛋白质 氨基酸残基（丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸）上的过程，是 生物体内一种普通的调节方生物体内一种普通的调节方 式，在细胞信号转导的过程 中起重要作用 激酶激酶（kinase）使底物磷酸化使底物磷酸化 中起重要作用 激酶激酶（kinase）使底物磷酸化使底物磷酸化 磷酸酶磷酸酶（phosphotase）使底物去磷酸化使底物去磷酸化 每个信号转导蛋白可以是激酶的底物自身又可以作为每个信号转导蛋白可以是激酶的底物，自身又可以作为 激酶，使其他底物磷酸化，从而将信号逐级传递并放大14 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 MAPK家族酶的激活机制都通过磷酸化的三级酶促级联反应家族酶的激活机制都通过磷酸化的三级酶促级联反应 15 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 蛋白激酶：蛋白激酶： 通过磷酸化蛋白底物发挥生物学功能通过磷酸化蛋白底物发挥生物学功能 不需要合成新的蛋白质不需要合成新的蛋白质 人类基因组中有人类基因组中有508个个 本身会被其它激酶或者自身磷酸化本身会被其它激酶或者自身磷酸化 是常用的小分子药物靶点是常用的小分子药物靶点 16 磷酸酶： 磷酸酶（phosphatase）是一种能够将对应底物去 磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上 的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟 基。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反。 不需要合成新的蛋白质 本身会被其它激酶或者自身磷酸化 是常用的小分子药物靶点 17 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 磷酸化修饰常用检测方法磷酸化修饰常用检测方法磷酸化修饰常用检测方法磷酸化修饰常用检测方法 Western blot、免疫组化和免疫荧光、流式细胞术 使用特异性抗磷酸化蛋白抗体（pThr、pSer 和pTyr ） 放射性核素32P 同位素放射性标记法放射性核素32P 同位素放射性标记法 体外激酶活性测定体外激酶活性测定 质谱分析法 18 磷酸化蛋白之磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项检测操作细节和注意事项 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑 制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。 2. 加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋 白只占总的蛋白量的极少部分。（4度也可使一抗重复使用多次,磷酸化的部使抗使次,磷 抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。） 3 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素3. 磷酸化抗体的好坏是个关键因素 5. 抗体的稀释倍数也要适当。不同抗体不同要求。 6 研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量6. 研究完某蛋白的磷酸化情况后最好也要研究下该蛋白总的表达量。 7. 做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的条带以外,往往会出现非特异性的条 带 磷酸化抗体不好的话 甚至会压出非特异性的条带 而没有你想要的条带带.磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的条带,而没有你想要的条带 ,所以曝光以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的条带分子量是否 确正确. 8. 磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以曝光时间要适当。 19 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 32P 同位素放射性标记法 同位素放射性标记法 体内代谢培养用 32P 同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸 化酶促反应，带有 32P 同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋 白上，通过凝胶电泳分离，可以用放射自显影或磷光成像仪检测磷酸化蛋 白质。但放射性标记只能在细胞中应用，比较局限且有放射性危险。白质但放射性标记只能在细胞中应用较局限且有放射性危险 培养细胞处于对数生长期，操作前318小时换液； 用含血清的无磷酸盐培养基无磷酸盐培养基冲洗细胞； 用含血清的无磷酸盐培养基无磷酸盐培养基冲洗细胞； 培养细胞中加入无磷酸盐培养基； 加入H332PO4使其终浓度为0.12mCi/mL（防护板后操作）； 将细胞培养皿放入树脂盒内放入孵箱中一般标记1 2小时即可； 将细胞培养皿放入树脂盒内，放入孵箱中，般标记12小时即可； 孵育结束后，取出细胞培养皿，吸去培养液，用预冷的缓冲液洗涤细胞； 在培养皿中加入裂解液，裂解细胞，收集细胞裂解液； 选用适当方法分析标记的蛋白质经SDS PAGE后通过放射性自显影或磷光 选用适当方法分析：标记的蛋白质经SDSPAGE后，通过放射性自显影或磷光 成像仪检测。 注：操作过程中注意操作者的防护，涉及放射性的耗材需要特殊处理。 20 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 运用质谱可以测定蛋白质的一级结构包括分子量肽链氨基酸 组学质谱分析组学质谱分析 运用质谱可以测定蛋白质的级结构，包括分子量、肽链氨基酸 排序及多肽或二硫键数目及其位置，是一种可发现和鉴别翻译后修饰 的方法。 基于质谱的蛋白磷酸化分析包括： 识别磷酸化多肽的存在； 根据氨基酸序列确定磷酸化类型根据氨基酸序列确定磷酸化类型； 确定磷酸化位点； 在能够识别磷蛋白质的生物环境下，实时定量确定蛋白磷酸化位点。 蛋白磷酸化理论上都可以运用质谱检测，但质谱分析酶解磷酸化 蛋白并不能检测全部蛋白序列，可能会有重要磷酸化区域被忽略，且蛋白并不能检测全部蛋白序列，可能会有重要磷酸化区域被忽略，且 细胞中磷酸化蛋白含量甚微，磷酸化肽段的信号容易被非磷酸化肽段 的信号所抑制，所以有必要在质谱分析之前进行磷酸化蛋白和肽段的 富集富集。 21 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 细胞裂解细胞裂解 蛋白抽提 蛋白水解消化 磷酸化多肽富集 磷酸化多肽质谱分析 22 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 23 信号通路检测：磷酸化修饰信号通路检测：磷酸化修饰 蛋白激酶与磷酸酶抑制剂的应用蛋白激酶与磷酸酶抑制剂的应用