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流式细胞仪标本处理一般原则及方法,流式细胞仪使用一般方法及技巧,临床流式细胞仪应用简介,殷跃锋,流式细胞仪原理介绍,双光源系统流式细胞仪,在管道大约50倍直径距离处,鞘液中心速度与边缘速度达到稳定,形成稳定的层流。,样本与鞘液未入管道时,边缘与中心速度一致。,进入管道后,受管壁粘性阻力边缘速度下降,中心速度不变。,流体形成层流后,会产生流体聚焦效应,所有颗粒均被推致流速最快的液流中。,颗粒以衡定的速度作匀速运动。,无论每秒检测数量为多少,颗粒经过检测区的速度是衡定的,流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法,标本来源: 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。,根据各种具体实验,选用不同的抗凝剂。 可用的抗凝剂如下:,EDTA: 2mg/ml 枸椽酸钠:0.38% 肝素:15IU/ml,标本处理时间:,新鲜样本分析时,样本采集后应立即分析,样本固定方法: 1%的多聚甲醛或75%的酒精,作用30分钟。 注:不同的实验,所用的固定方法不完全相同。,样本处理标准试剂:,一、10%Bovine Serum Albumin BSA,1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中,2. 4C,20000 g离心30分钟,3. 分装后-20C保存,二、0.1% BSA-PBS缓冲液,1. 准备500ml,PH7.3 PBS,2. 加入5ml 10% BSA,3. 使用0.45um滤网过滤,三、氯化铵溶血剂,1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA,2. 调节PH值至7.2,3. 在使用前配置该溶血剂,并用0.45um滤膜过滤,方法一:溶血法,取100 ul抗凝全血;,2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀;,3. 室温孵育10分钟;,4. 4C,400g离心10分钟。去上清,加入2ml BSA-PBS;,5. 4C,400g离心10分钟。去上清,加入2ml BSA-PBS;,6. 4C,400g离心10分钟。去上清,调整细胞浓度至5x106/ml。,富集白细胞,注:化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有:以草酸为主的溶血剂(Coulter Q-Prep),基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。,优点:溶血时间快?,在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。,缺点:需严格掌握溶血时间,对白细胞表面抗原有影响,随时间细胞形态变化大。,方法二:密度离心法提取单个核细胞,Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠)混合物,其密度为1.1191.077。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.1191.077的血浆层,而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。,1. 准备2ml抗凝血(根据实验要求确定用血量), 等量PBS稀释;,2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma);,3. 室温下700g离心30分钟;,4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出;,5. 加4ml BSA-PBS,400g离心10分钟;,6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。,操 作,淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散,容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。,从组织获取淋巴细胞,将样本置于陪替氏培养皿,加入15ml BSA-PBS; 将样本切成3-4mm3大小,用镊子将其分离; 将样本经滤网过滤,用密度法分离、提纯淋巴细胞。,方 法:,其他标本:通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本,处理方法也各不相同。,制备大鼠肾脏浸润细胞,解剖刀、CO2孵育箱、滤网 以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液(无血清),材料:,方 法:,1. 将样本置于皮氏培养皿,用解培刀切成小块;,2. 加入10ml胶原酶溶液,37C CO2培养箱孵育30分钟;,3. 滤网过滤;,4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。,其他类型细胞,在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不同组织处理方法也各异,以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细胞。,材 料,解剖刀 0.15%胰蛋白酶 Hankss缓冲盐或PBS,pH7.3 不含Ca、Mg离子的HBSS II型胶原酶 1%BSA或5%FBS 5ml的吸样管 35um尼龙滤网 DNase,将样本置于皮氏培养皿,加15ml BSA-PBS,将样本切 成1mm3大小,用镊子将其分离; HBSS或PBS洗清 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS; 37C摇床上孵育1560分钟,视样本类型而定;,操 作,用5ml的吸样管反复吹打,制成单个细胞悬液; 使用35um滤网过滤,300g离心5分钟; 用PBS或细胞培养液重悬样本;对于某些样本过滤后仍有小块组织,重复第5步获取细胞,重复第7步; 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬, 37C孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS,灭活酶活性。,细胞培养,许多原代细胞和培养细胞系,都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液,需注意消化过度会损害细胞,特别是改变其表面抗原标记。 准备单细胞悬液 1.仪器和试剂: 0.25%r EDTA,pH 7.2 0.25% 的胰酶 10%血清的培养液 2.方法: a. PBS洗涤细胞; b. 加入0.25%有胰酶,37C处理28分钟; c. 倒置显微镜下观察,至大部分细胞脱落悬浮后,加入含10%血清的培养液。 d. PBS液洗涤细胞,最后配成终浓度为1106/ml 的细胞悬液。,样 本 处 理,抗体染色一般方法,外周血白细胞分析:100ul全血 血小板分析:15ul全血(根据样本血小板数量) 红细胞分析:1ul全血(根据样本中红细胞数稀释后使用) 骨髓:100ul 其他样本,计数后决定使用体积,目标细胞数量及检测终浓度:1106/ml,细胞计数方法,传统手工计数:耗时、准确度差 流式细胞仪计数: BD,Coulter仪器:高速4ul/秒,中速2ul/秒,低速0.5ul/秒? partec仪器:最为精密的细胞计数器,直接报告细胞浓度,反应体积,样本中加完抗体后, 1106细胞反应体积应不小于100ul。,抗体染色,最为普通的抗体染色原则: 1106细胞对1 ug 抗体(抗体供应商所推荐使用单位),此浓度90%处于过饱合状态 精确使用:滴定抗体,抗体对于抗原恰达到饱合浓度,SPECIFIC ANTIBODY,NON-SPECIFIC ANTIBODY,CONCENTRATION,AMOUNT BOUND,抗体滴定原理,流式细胞仪抗体滴定方法,孵育、溶血、固定,抗体孵育:室温下避光15分钟(某些情况下如:细胞内因子检测需冰育) 溶血:如样本含中有红细胞需溶血(见下页) 样本溶血后需立即上机检测,固定后可放置较长时间,白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂):,1,100ul外周血,加入100ul溶血剂,2,混匀后,室温下孵育10分钟,3,加入2ml蒸馏水,混匀后室温下孵育10分钟,4,根据实验需要,免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬,优点:试剂为温和型溶血剂,不影响细胞表面抗原及溶血时间无需精确把握,各溶血剂性能比较,抗体标记荧光素及其他荧光染料,荧光激发及发射原理,能量级,能量损失,标记抗体常用荧光素 FITC,激发光:488nm 发射光:525nm;使用面最广,价格便宜,Alexa Green具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱,PE,激发光488nm 发射光575nm 此荧光的激发效率最佳,故此荧光得到的信号最强 检测某些弱表达的抗原,推荐使用此荧光素 价格较FITC昂贵,PE-Cy5 TC,激发光488nm, 发射光667nm,为复合荧光素,荧光激发较率较高,信号强,FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光,并经常将三者共同使用进行三色分析,PE-Cy7,激发光488nm, 发射光767nm 为复合荧光素,2000年后被开发出来,激发效率佳 与前三者联进可进行单激光四色分析(488nm),光谱之间影响较小,APC,激发光633nm, 发射光660,在配有双激光的流式细胞仪上,此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现,故使用该染料意义不大。,核酸染料,细胞膜电位、离子、脂类探针,现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针,运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能,可实现一些异想不到的效果。 详细信息,见细胞探针公司网站: www.molecularP,与流式细胞仪相关的荧光术语,MESF(Molecules of equivalent soluble fluorochrome)等量可溶性荧光分子:国际标准单位,用来衡量荧光强度 自发荧光:细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为6501150MESF,血小板及其他颗粒自发荧光更低 流式细胞仪精度:分析白细胞要求精度在1000MESF以内,分析其他细胞或颗粒需要更高的精度:300MESF以内,第二部分,流式细胞仪使用一般方法及技巧,上机检测,样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测 打开流式细胞仪:预热及进行质控程序 选择相应的方案或新建方案 加载或重新调节各参数 上样检测,技巧一:定位目标细胞群体,寻找细胞群:如标本为外周血,在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞,依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞,可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。 使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号,可最快、最特异性地定位目标细胞群 如标本中无明显特征细胞群,可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群,技巧二:阴性对照,阴性对照作用:调节PMT电压;设立阴、阳性界线 使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照,注对照及抗体需出自同一厂家(检测一过性样本中的某些指标) 使用对照组样本作阴性对照(与其他实验中对照组含意相同,但此时仍需使阴性对照初始化仪器) 对与非抗体染色,如各类核酸染料或探针:PI、ANNEXIN-V。使用空白标本作为阴性对照,或设立阳性对照。,技巧三:常见故障及解决,时刻注意鞘液及废液桶液量,熟悉仪器各类报警信号 通过软件操作仪器,很少能引起仪器硬件固障 如样本中有可见颗粒,建议过滤后再检测 如仪器经常不使用,管道会结晶、长菌、堵塞、漏气,此时叫工程师便可解决 如仪器出现硬件故障,通常是仪器自身问题,与操作者无关,技巧四:检测指标,检测前要清楚地知道:除阳性百分比指标外,还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义 检测时,灵活应用放大模式:线性或对数(如指标相差不大,使用线性放大,如:SS、FS;一般荧光参数使用对数放大) 灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能,可使检测结果更为明了 合理选择不同的荧光素标记试剂,以最少的投入获取最多的信息,荧光补偿:极其重要的操作,FITC与PE,调与未调补偿,FL1,FL2,补偿调节原理,补偿调节原理,双色荧光补偿调节标准方法:第一步,IgGFITC/IgGPE 通过调节电压使阴性群体落在FTIC 及PE 双阴性区注在 进行调补偿时必须将原补偿全部归零,双色荧光补偿调节标准方法:第二步,FITC 标记抗体/IgGPE,双色荧光补偿调节标准方法:第三步,通过补偿设置按钮增、减补偿百分数,因为:,所以:,注意!,用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号,否则就不会出现荧光渗漏现像,调节补偿也无从入手。 在正式数据采集前要调整好补偿,一旦数据被获取,BD、Coulter仪器无法再改变补偿 partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术,无论
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