基因工程药物检验,内容提要,一、基因工程药物概述,1、含义： 基因工程药物是指将生物体内生理活性物质的基因分离纯化或者人工合成，利用重组技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞或转基因动物中大量表达，通过这种方法而生产的新型药物。,2、特点： 基因工程药物因其疗效好、应用范围广泛、副作用小的特点成为新药研究开发的新宠，也是发展最迅速和最活跃的领域。自1982年美国Lilly公司上市了第一个基因工程产品 人胰岛素以来，至今已有基因工程药物大约140多种上市，尚处于临床试验或申报阶段的基因工程药物有500多种。当传统制药业的增长速度减慢时，基因工程制药正在加速发展，全世界基因工程药物持续6年销售额增长率都在l533，基因工程制药已成为制药业的一个新亮点。,3、基因工程药物与一般药物比较 : 它是利用活的细胞作为表达系统， 所获得的蛋白质产品往往相对分子质量较大，并具有 复杂的结构； 许多基因工程药物是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质； 宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。,二、药典中基因工程药物名称列表,目前基因工程药物的主要类型,1 干扰素： 是哺乳动物细胞在诱导下产生的一种淋巴因子，能够加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用，抑制病毒在细胞内的增殖，用于肿瘤和其他病毒病的治疗。 2 生长激素： 人体生长激素能够治疗侏儒症和促进伤口愈合，动物生长激素能够加速畜禽生长发育。目前，人和动物的生长激素基因都已经在大肠杆菌中成功表达在医学和畜牧业领域取得了很好的应用效果。,3 红细胞生成素： 是一种肾脏产生的作用于肾髓的造血相关细胞因子，使原始红细胞的成熟期缩短，调节。肾髓中的造血细胞含量，用于。肾功能不全引起的贫血、放射化疗引起的贫血以及其他一些罕见的贫血症的治疗还可用于外科手术前准备自体输血的病人。红细胞生成素目前是在培养的哺乳动物细胞中表达，但成本较高，生产过程复杂。 4 白细胞介素： 是一种抗肿瘤免疫因子可促进T细胞的生长、增殖和分化，也可促进B细胞的生长和增殖，同时能够增强杀伤性淋巴细胞的功能，也用于癌症的治疗。,5 集落刺激因子： 分为2类：一类为粒细胞集落刺激因子，另一类为巨噬细胞集落刺激因子。二者都可促进体内白细胞的增殖，增强粒细胞的功能，调控造血功能，用于肿瘤病人化疗后白细胞下降等的治疗。,三、基因工程药物质量要求,（1）要求提供关于表达体系的详细资料，以及工程菌 (或工程细胞)的特征、纯度(是否污染外来因子)和遗传稳定性等资料。 (2) 提供培养方法和产量稳定性、纯化方法以及各步中间产品的收率和纯度、除去微量的外来抗原、核酸、病毒或微生物等方法。 (3) 要求进行理化鉴定，包括产品的特征、纯度及与天然产品的一致性。一般纯度应在95%以上。 (4) 要求进行外源核酸和抗原检测，规定每剂量DNA含量不超过100pg，细胞培养产品中小牛血清含量须合格。成品中不应含有纯化过程中使用的试剂，包括层析柱试剂和亲和层析用的鼠IgG。,(5) 生物活性或效力试验结果应与天然产品进行比较。 (6) 基因工程产品的理化和生物学性质与天然产品完全相同者一般不需重复所有动物毒性试验，与天然产品略有不同者需做较多试验，与天然产品有很大不同者则须做更多试验， 包括致癌、致畸和对生育力的影响等。 (7) 所有基因工程产品都必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。 （8）所有基因工程产品都必须经过临床试验，以评价其安全性和有效性。,四、基因工程药物的质控要点,是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。,1)原材料的控制： 表达载体和宿主细胞 克隆基因的序列 2)生产的控制： 原始细胞库 有限代次的生产 连续培养生产 分离纯化,3)终产品的质量控制,方法：电泳法、免疫学分析法、受体结合试验 和高效液相色谱法等 内容：氨基酸成分分析、肽图分析、蛋白质 浓度及分子量测定、蛋白质二硫键分析,1)产品的鉴定：,2)纯度分析：,目的蛋白质的含量测定,产物杂质检测,宿主细胞蛋白、病素和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及DNA等,四、基因工程药物分析方法,(一)化学检定法 1 Lowry法测定蛋白质含量 2 用电泳法(非还原型SDS-PAGE法)测定纯度 3 用高效液相色谱(HPLC)法测定纯度 4 用电泳法(还原型SDS-PAGE法)测定相对分子质量 5 用等电聚焦电泳法测等电点 6 氨苄青霉素残留量测定,(二)肽图分析法 肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特征，比较功能相近的蛋白质结构的类似性和各批产品的蛋白质一级结构的一致性。,(三)外源性DNA残留量的测定 检测残留DNA的方法可采用杂交分析技术、顺序单独分析技术或其他灵敏的分析技术。 (四)宿主细胞蛋白杂质的检测 宿主蛋白是基因工程药物特有的杂质，其含量是质量控制的一项重要指标,(五)无菌试验 基因工程药物和其他生物制品不得含有杂菌，灭活疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。 (六)内毒素试验 基因工程药物内毒素的检定按照中国生物制品规程的规定进行。,(七)异常毒性试验 异常毒性试验是指各制品的特异性毒性试验以外的一般安全试验。目的是通过动物试验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。 (八)热原质试验 基因工程药物热原质的检定按照中国生物制品规程的规定进行。,(九)生物学活性(效价)检定 各种基因工程药物活性(效价)的检定按照中国生物制品规程的规定进行。,常用检测方法小结： 杂质和污染物 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热原法 宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE 其它蛋白杂质 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE 残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 蛋白变异 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 甲酰蛋氨酸 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 蛋氨酸氧化 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、质谱、 凝胶过滤,杂质和污染物 检 测 方 法 单克隆抗体 SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE 微生物 微生物学检查 支原体 微生物学检查 病毒 微生物学检查,五、代表性药物实例介绍,干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。型干扰素在分为1b 2a 2b等亚型。,（一）基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC,退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆 含干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达,（二）基因工程干扰素的制备,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装,1、原液检定,(1)效价测定用国家标准品校准确定效价(u) (2)蛋白质含量用Lowry法测定 (3)比活性应不低于1.0*107U/mg蛋白。 (4)纯度 wwwdocinGorti 电泳法用非还原型SDS-PAGE法。 高效液相色谱法用波长280mn检测,(5)相对分子质量用还原型SDS-PAGE法 (6)外源性DNA残留量用固相斑点杂交法 (7) IgG残留量如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行本项检定；采用双抗体夹心酶联免疫法测定。 (8)宿主菌蛋白残留量用酶联免疫法测定。 (9)残余抗生素活性不应有残余氨苄青霉素活性,(10)细菌内毒素含量按2000版规程通则生物制品细菌内毒素试验规程测定 (11)等电点为4.0-6.5，批与批之间等电点应一致 (12)紫外光谱扫描 (13)肽图(至少每半年测定1次)应符合干扰素odb的图形，或与对照品图形一致。 (14)N-末端氨基酸序列 (至少每年测定1次)用氨基酸序列分析仪测定。,2半成品检定,(1) 细菌内毒素含量按规程通则生物制品细菌内毒素试验规程测定； (2) 无菌试验按规程通则生物制品无菌试验规程A项进行,3成品检定,(1)鉴别试验用中和试验法 (2)外观应为白色薄壳状疏松体 (3)化学检定按2000版规程附录生物制品化学及其他检定方法进行： pH值为6.57.5 水分应不高于3.0%,(4)效价测定方法见附录，用国家标准品校准确定效价(U)； (5)无菌试验按2000版规程通则生物制品无菌试验规程A项进行； (6)异常毒性试验按2000版规程通则生物制品异常毒性试验规程小鼠试验项进行； (7)热原质试验按2000版规程通则生物制品热原质试验规程进行。,参考文献,郭俊清 ，徐进，李建正.基因工程药物研究概况J.畜牧与饲料科学, 2011，32(7)：94-9. 胡文，陈惠鹏，汤仲明，等生物制药的现状和未来(一)：历史与现实市场J中国生物工程杂志，2004，24(12)：95-101 吴晓英，范一文，周世水.生物药物分析与检验M.第二版.北京：化学工业出版社，2011. 中国药典三部（2010版）,