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植物病原细菌学实验 实验一 植物病原细菌常用培养基 的制作与灭菌 1.了解细菌培养基的种类; 2.掌握常用细菌培养基的配方和制作方法; 3.掌握培养基的灭菌方法。 一、实验目的 二、实验内容和操作方法 (1)配方:牛肉膏3,蛋白胨 10,NaCl 5,琼 脂 20,蒸馏水 1000 L。 1.牛肉膏蛋白胨培养基(NA):分离和培养最常用 (2)配制过程:将牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 溶于蒸馏 水后,调节pH7.2,加入琼脂溶化后分装于三角瓶和 试管。 (一)培养基的配制 2. Hugh和Leifson(HL)培养基:细菌的好氧性和厌 氧性测定 蛋白胨 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 0.2 g 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1000.0 ml pH 7.47.8 溴百里酚兰(1.6酒精溶液 1.5 ml) 待培养基融化,并调pH后,装于试管中,每支试管装9 ml 灭菌。培养基凝固后,用接种针蘸细菌悬浮液针刺 接种,一直刺到管底。分别在培养2、4和7 d后观察记 录。 好氧性细菌,只在开管的上部生长;兼性厌氧性细菌 ,则在开管的上下部都能生长;厌氧性细菌,则只能在 开管的下部和闭管中生长。 (1)配方:NH4H2PO41.0,氯化钾0.2, MgSO4.7H2O 0.2,蒸馏水1000 L,溴百里酚兰( 1.6%酒精溶液)1.5 mL; 1%碳素化合物。 3.Ayers培养基:碳素化合物产酸试验 单糖(葡萄糖、半乳糖);双糖(麦芽糖、乳糖) ;多糖(淀粉);醇(甘露醇)。 有的细菌不产酸和气,有的只产酸不产气,少数植 物病原细菌既产酸又产气 (3)分装:将上述培养基分装于试管中,每管10 mL左右。如果测定气体产生,加上杜氏发酵小玻管 后灭菌。 产酸时培养液变黄,产碱时变蓝,产气则小玻管内 培养液被部分排出,出现空隙。 (2)配制过程:将NH4H2PO4、氯化钾、 MgSO4.7H2O溶于蒸馏水,调节pH7.0后加入溴百里 酚兰,最后加入碳素化合物(也可分别灭菌后加入) 4. MR和VP试验:对葡萄糖的分解能力 (1)配方:蛋白胨5,葡萄糖5,磷酸氢 二钾5,蒸馏水 1000 L。 (2)配制过程:将蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢 二钾溶于蒸馏水,调节 pH7.0-7.2,每管分装 5mL即可。 5. 硝酸盐还原 (1)配方:硝酸钾1.0,蛋白胨5.0,酵母 膏3.0,蒸馏水1000L, pH7.0-7.2 (2)配制过程:将硝酸钾、蛋白胨、酵母膏 称好后,溶解于蒸馏水后,调节 pH。 6. 半胱氨酸培养液:测定产H2S能力 (1)配方:蛋白胨10,硫酸钠0.1g,半胱氨 酸0.1g,蒸馏水1000L。 (2)配制过程:将半胱氨酸、蛋白胨、硫酸 钠称好后,溶解于水中,调节 pH7.0-7.3即可。 7. 吲哚试验 (1)配方: 蛋白胨20.0,磷酸氢二钠2.0g, 葡萄糖10.0g,蒸馏水1000L。 (2)配制过程:将蛋白胨等称好后,溶解于 蒸馏水,调节pH7.0-7.2即可。 8. 明胶液化 (1)配方: 牛肉浸膏3.0g,蛋白胨5.0,明 胶10-12%,蒸馏水1000L。 (2)配制过程:将牛肉浸膏、蛋白胨溶解于 蒸馏水中,调节pH7.0-7.2后,将明胶溶解于此 溶液中,即可分装于试管中。 9. 淀粉水解试验 (1)配方: 牛肉浸膏3.0 g,蛋白胨17.5, 淀粉1.5 g,琼脂15-20 g,蒸馏水1000 L。 (2)配制过程:将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉 称好后,溶解于蒸馏水中,加入称好的琼脂, 待融化后调节pH7.0-7.2。 10. 石蕊牛乳反应 (1)配方: 脱脂牛乳1000 L , 石蕊液(4%)15-20 mL。 (2)配制过程:提前配制石蕊液 (二)培养基的灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进 行灭菌。普通培养基为1212030min,以保证 灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭 菌后,如需要作斜面固体培养基,则灭菌后立即摆 放成斜面,斜面长度一般以不超过试管长度的1/2 为宜;半固体培养基灭菌后,垂直冷凝成半固体深 层琼脂。 明胶培养基灭菌12-15分钟。 石蕊牛乳培养基间歇灭菌3次,每次通蒸汽20-30 分钟。 灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生 物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。 本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌。 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。 通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀 菌目的。 高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是基于水的沸 点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。 当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高 到121,经2030min,可全部杀死锅内物品上 的各种微生物和它们的孢子或芽孢。 一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等 都可应用此法灭菌。 操作方法和注意事项如下: 加水 打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线。注意水要 加够,防止灭菌过程中干锅。 装料、加盖 灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式 均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气 。 排气 打开放气阀。用电炉加热,待水煮沸后,水蒸 气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时 ,维持5min,使锅内冷空气完全排净。 升压、保压和降压 当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开 始上升。当压力上升至所需压力时,控制电压以维 持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求( 一般培养基和器皿灭菌控制在121,20min)后 ,停止加热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀。 注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下 降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。 干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭 菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后,放入电烘 箱中烘烤,即加热至160170维持12h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。 凡带有胶皮的物品,液体及固体培养基等都不能用 此法灭菌。 1 细菌(NA)和真菌(PDA)常用培养基的配方和制 作过程有何异同点? 2 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 三、作业 实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定 二、实验内容和操作方法 (1)首先要选择典型、新鲜病组织; (2)以灭菌剪将病斑剪下,略带健康组织, 大小约0.51公分左右,放在灭菌载玻片中央 ,加无菌水1d。加上灭菌盖玻片,静置约 10min左右,观察是否有云雾状自破口处涌出 (一)细菌溢现象观察 (1)斑点型:如棉花角斑病。 A. 剪取新鲜的典型病斑,约1cm见方。 (二)植物病原细菌的分离 1. 细菌悬浮液的配制(不同症状类型分离材 料的选择和表面消毒) B.表面消毒:将切取的组织块在70乙醇中 浸一下立即取出,然后用表面消毒剂进行表面 消毒,可以采用0.1升汞,152min或0.5 的次亚氯酸盐如漂白粉(1:9稀释液)2min C.消毒后用灭菌水洗涤3次,将病组织放在 另一个培养皿的灭菌水中,剪破中心或以灭菌 玻璃棒研碎病组织静置2030分钟,等细菌游 出。 (2)萎蔫型如茄青枯病 将茎部剪成12寸长,表面用70酒精轻拭 ,在火焰上表面消毒,以灭菌刀纵剖,选择轻 微变色病部,以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑 出病健交界处组织(可以不再消毒),加灭菌 水浸泡20-30分钟。 如果茎部较粗,也可以在表面消毒后用解剖 刀横断茎部,用夹子或手紧压茎部横断面,挤 出溢脓或汁液。 (3)肿瘤组织 软瘤比较容易分离;木质瘤可以磨碎后接 种在向日葵、番茄等幼株上长出瘤后再分离。 由于细菌位于表皮细胞和木质部之间,因 此应用酒精棉花擦拭表面,在火焰上表面消毒 ,再在灭菌皿中实行解剖后以灭菌玻棒将其捣 碎,静置浸泡24h。 (4)腐烂组织 较简单,选择近病部交界处以接种环挑取少 量腐烂组织,稀释。 (5)种子带菌的分离 选择病种子,以0.1升汞液表面消毒1 2min,灭菌水洗涤,再将此种子在70酒精中 浸几分钟,洗涤23次,取出放在研钵中磨碎 ,离心取上清液。 2. 分离方法 A.倒平板:注意培养基的温度不能太高,否 则冷凝水太多,细菌在水中游动而影响单个分 散菌落的形成。 (1)平板划线分离法:被普遍采用 B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液,在已凝 固的平板培养基表面划线 如果菌液浓度大,培养皿 转动角度减小,增加划线 的次数 划4条线后,将接种环灭菌 ,培养皿转动90,从第2 条线开始划45条线 (2)培养皿稀释分离法 0 原液 1 取1环菌液 0.5L灭菌水 2 混匀后取1环 3 混匀后取1环 4 混匀后取1环 5 混匀后取1环 3.培养 一般放置在 2830温箱中倒置培养,时 间23 d。 将冷却至45左右的培养基倒入装有稀释 菌液的培养皿中,轻轻转动培养皿,使菌液和 培养基混匀,待其凝固后培养。 4.细菌的纯化 挑取分离出的典型单菌落平板划线培养(2 皿),如此重复12次,最后,在均匀一致的 平板中,挑取典型菌落移植在斜面培养基上培 养,长成后在4环境中保存菌种。 1. 配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液,菌龄48 小时左右; (二)致病性测定 2. 指示植物的选择:一般用烟草,在假单胞和 黄单胞菌属上较适用。 3. 接种方法:用注射器将细菌液从烟草下表皮 注入叶肉细胞间。用灭菌水作阴性对照,同属 HR阳性的菌株作阳性对照。 4. 培养条件:接种后的植物应保持在25,相 对湿度较高(85%)的条件下。 5. 结果观察:在2448h表现枯斑为阳性反应 ,3d左右出现黄斑为阴性反应。 三 作业: 1.简述本实验中植物病原细菌的分离步骤及其操作注 意事项 2. 烟草过敏性反应试验能够确定细菌的致病性吗?为 什么? 实验三 植物病原细菌的形态观察 1.了解革兰氏染色鉴定的快速鉴定方法; 2.掌握革兰氏染色和鞭毛染色的方法; 3.掌握细菌培养性状的描述特征。 一、实验目的 二、实验内容和操作方法 1.结晶紫草酸铵染色 (一)革兰氏染色 (1)试剂 A. 结晶紫草酸铵染剂: 溶液:结晶紫2.0g,酒精(95%)20mL 混合溶液和,过滤,贮藏于试剂瓶中,24h后 使用。 溶液:草酸铵0.8g,蒸馏水80mL C.复染剂 原液:番红O 2.5g,95%酒精100mL 复染剂:原液10mL,蒸馏水90mL B. 鲁戈尔碘液:碘1.0g,碘化钾2g蒸馏水300mL。 将碘和碘化钾在研钵中研和,慢慢加水并继续研 和直至碘和碘化钾溶解,然后加水稀释到300mL,盛 入棕色试剂瓶,放暗处备用。 (2)染色程序 A. 配制细菌悬浮液:菌龄16h B. 在干净的载玻片上涂片、风干,不要加热,然后在 火焰上通过2次,固定玻片。 C. 结晶紫染色1分钟,水洗数秒钟,吸干。 D. 碘液处理1分钟,水洗,吸干。 E. 用95%酒精褪色约30秒。水洗,吸干 F. 番红O复染10秒,水洗,吸干 G. 加1滴香柏油,在油镜下镜检,红色为革兰氏阴性 菌,紫色为革兰氏阳性菌。 2. 氢氧化钾溶解试验 (1)试剂:3氢氧化钾 (2)方法:取12滴3氢氧化钾溶液置于干净的 玻片上,用牙签取新鲜细菌培养物与氢氧化钾混合, 充分搅拌1020秒,如果液滴变粘稠并可拉出丝状物 体,表示测试菌为革兰氏阴性菌,反之则为革兰氏阳 性菌。 1.试剂 (二)鞭毛染色(西萨基尔法) (1)媒染剂:单宁酸10g,ALCL3.6H2O 18g, ZnCL2 10g,碱性品红1.5g,60%酒精40mL 在研钵中加入酒精和上述各种成分,充分研磨后, 再加入其余的酒精。使用前用蒸馏水稀释2倍,染色时 过滤,滤液直接滴在涂片上。 溶液:碱性品红0.3g,酒精(95%)10mL 溶液和分别配制后混合。 溶液:苯酚(结晶)5g,蒸馏水95mL (2)染液: 2. 染色步骤 (1)载玻片准备:选用新的或没有
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