紫外-可见分光光度法讲议,第一节 紫外-可见分光光度法,研究物质在紫外光、可见光光区的分子吸收光谱的分析方法称为紫外-可见分光光度法。 紫外可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收在200 800 nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。,第二节 光吸收基本定律和吸收系数,1.光吸收基本定律： 比尔郎伯（BeerLambert）定律为光吸收基本定律，是分光光度分析的理论基础。 Lambert于1730年提出了光强度与吸收介质厚度的关系。1852年Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物质浓度之间的关系。,透光率： 单色光通过一物质的溶液时透过光的强度（I）与入射光的强度（I0)之比称为透光率或透射比（T）。 T I I0 吸收度： 透光率的负对数称为吸收度或光密度。 A=log1/T=logT,郎伯（Lambert）定律: 当溶液浓度不变时，吸收度与溶液的液层厚度成正比。 比尔（Beer）定律： 当溶液液层厚度不变时，吸收度与溶液的浓度成正比。,郎伯比尔（Lambert Beer ）定律: 单色光通过一物质的溶液时，如果入射光的强度不变，溶液吸收度（A）与溶液浓度（C）和液层厚度（L）成正比。 A=log1/T=ECL 式中E为吸收系数,2.吸收系数： 定义：吸光物质在单位浓度和单位液层厚度时的吸收度。 表示方法： （1）百分吸收系数（E）： 当溶液浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm时，相应的吸收度为百分吸收系数，以E表示。 E=A/C(%)L(cm) 中国药典规定的吸收系数即为E。,（2）摩尔吸收系数（）： 当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长度（L）为1cm时，相应的吸收系数为摩尔吸收系数，以表示。 =A/C(mol/L)L(cm) 和E的关系是： =E分子量/10 E= 10/分子量,第三节.分光光度计组成,基本原理框图：,光 源,单色器,吸收池,检测器,讯号处理 及显示器,（一）光源,可见光区，常用钨灯做为光源，可使用的范围在340 2500nm。 紫外光区，常用氢灯或氘灯做为光源。可使用的范围在160 375 nm。 仪器必须配有稳压装置。,（二）单色器,单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。 能产生单色光的色散元件主要是: 棱镜和光栅。,（三.）吸收池： 吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。,玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只能用于320nm以上的可见光区。 石英吸收池因不吸收紫外光而常用于300nm以下的紫外光区，但也可用于可见光区。 最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。,（四.）检测器： 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化，是将光信号转换成电信号的一种装置。,紫外可见分光光度计的校正,波长校正用汞灯、氘灯、钬玻璃 吸光度准确度用重铬酸钾的硫酸溶液 杂散光检查1%碘化钠溶液、5%亚硝酸钠溶液,第四节 样品测定操作方法,一.吸收系数测定（性状项下）: 按各该品种项下规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长测定其吸收度，并计算吸收系数，应符合规定范围。,二.鉴别及检查: 按各该品种项下的规定，测定供试品溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收与最小吸收的比值，均应符合规定。,三.含量测定: 1.对照品比较法 : 按各该品种项下规定的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的（100士10）以内，用同一溶剂，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度。,2.吸收系数法 按各该品种项下配制供试品溶液，在规定的波长及该波长士nm处测定其吸光度，按各该品种在规定条件下给出的吸收系数计算含量。 采用吸收系数法应对仪器进行校正后测定。,3.计算分光光度法 采用计算分光光度法的品种，应严格按各该品种项下规定的方法进行，用本法时应注意：有一些吸光度是在供试品或其成分吸收曲线的上升或下降陡坡部处测定，影响精度的因素较多，故应仔细操作，尽量使测定供试品和对照品的条件一致，若该品种不用对照品，如维生素A测定法（见中国药典附录），则应在测定前对仪器作仔细的校正和检定,第五节 注意事项,1.试验中所用的量瓶，移液管均应经检定校正、洗净后使用。 2.使用的石英吸收池必须洁净。吸收池在测定样品溶液前必须加以校正。 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装盛样品溶液以池体积的45为度。 使用挥发性溶液时应加盖。吸收池透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂。,吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。 吸收池使用后应用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保存。 吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3:1V/V）混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。,3. 测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要求。 可用1cm石英吸收池盛溶剂以空气为空白（即参比光路中不放置任何物质），测定其吸光度，应符合下表规定。 所用溶剂应不超过其截止使用波长。 每次测定时所用的溶剂，应采用同一厂牌批号，混合均匀的溶剂。,对溶剂的要求,溶剂的使用范围不能小于截至使用波长，如甲醇、乙醇的截至使用波长是205nm。 在使用前应检查所用溶剂在供试品测定的波长处是否符合要求（以空气为空白）。 220240nm 吸光度0.40 241250nm 吸光度0.20 251300nm 吸光度0.10 300nm以上 吸光度0.05,4 .称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少，转移稀释时所取溶积一般应不少于5ml。含量测定供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在0.5%以内。作鉴别或检查可取样品1份。,5. 供试品测试溶液的浓度，除各该品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸光度以在0.30.7之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸收度线性范围，配制合适的读数浓度。,6.选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸光度值会偏低，狭缝宽度的选择应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外测定的大部分品种，可以使用2nm缝宽，但对某些品种如青霉素钾及钠的吸光度检查则需用1nm缝宽或更窄，否则其264nm的吸光度会偏低。,7 .测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰2nm处，再多测几个点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长。除另有规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长nm以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。,第七节 检验记录单内容,检品名称：多潘立酮片 批 号：070524 检品编号：200703634 检验项目：含量测定 检验依据：中国药典2005年版二部附录A 紫外分光光度计编号： 检验日期： 天平编号： 称量日期： 室 温： 相对湿度： 检测条件：检测波长 nm 狭缝宽度 2.0 nm 标准规定：含多潘立酮应为标示量的90.0%110.0 空白溶剂检查,第七节 检验记录单内容,对照品溶液配制：取多潘立酮对照品约12.5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加水2.5ml与异丙醇12.5 ml，置水浴上加热溶解，冷却，加异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置25 ml量瓶中，加异丙醇至刻度, 振摇。 供试品溶液配制：取本品20片，精密称定，研细，精密称取约相当于多潘立酮10mg的量，置50ml量瓶中，加水5ml，振摇，加异丙醇25 ml，置水浴上加热10分钟并时时振摇使溶解，放冷，加异丙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加异丙醇至刻度, 振摇。,第七节 检验记录单内容,测定方法：取上述二溶液，在288nm的波长处分别测定吸光度。 标准物质名称: 批号： 标准物质含量： 标准物质来源: 中国药品生物制品药品检定所 试验计算 试验结果 试验结论,