微生物应用技术曹理想中山大学生物化学系主要内容：n前言n微生物多样性与微生物资源开发技术n发酵培养与下游技术n育种技术n检测技术n药物筛选技术n细菌生物膜与细菌信号传导n燃料电池与生物传感器n生物转化技术n疫苗前言n微生物的特性：1、体积小、面积大2、吸收多、转化快3、生长旺、繁殖快4、易变异、适应强5、种类多、分布广第一章微生物多样性与微生物资源开发利用1微生物多样性分类多样性：古细菌（产甲烷细菌、极端嗜盐菌、极端嗜热菌）真细菌（有11个分支，目前在生物技术上重要的菌种属于革兰氏阳性菌与紫细菌）紫细菌（蛋白细菌proteobacteria)n包括紫色光合细菌与非光合型的革兰氏阴性菌，分为四个亚门（、）亚门：土壤杆菌属、根瘤菌属、立克次氏体属亚门：硫杆菌属亚门：肠杆菌科及某些假单胞菌革兰氏阳性菌n低GC含量的多为梭菌、芽孢杆菌、乳酸菌、葡萄球菌等n高GC含量为放线菌群微生物，有三类：1、长而细的杆状细菌（节杆菌属、纤维单胞菌属）与球状的微球菌属2、棒状杆菌分枝杆菌诺卡氏菌3、链霉菌属及其近缘种1微生物多样性n分类多样性n功能多样性n化学多样性（代谢物结构多样性）2微生物资源开发利用2.1历史n1、酿酒业、面包业n2、5060年代，大规模开发与发酵工业兴起目前利用方式：1、微生物菌体利用2、微生物代谢物利用3、微生物特性利用4、其他（废物资源再利用、工业污染废物降解与净化）2.2微生物资源开发利用技术n在科学上荣誉属于那些征服世界的人，而不属于首先产生这种观念的人，著名人物往往是征服了世界的人们他们发展一种技术、一种工具，或者提出一个受到普遍采纳的概念，或清楚地解释他们的发现，从而促进科学的发展和繁荣。2.2微生物资源开发利用技术n1、显微镜技术n2、无菌技术n3、纯种分离技术n4、纯培养技术n5、通气搅拌的好气性发酵工程技术n6、人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术n7、发酵动力学、发酵的连续化自动化工程技术n8、微生物酶反应生物合成和化学合成反应相结合纯培养技术与科赫法则的不足n不了解病毒n两种以上微生物在致病方面与干酪发酵过程的协同作用n对海洋微生物、瘤胃微生物、肠道微生物的研究需掌握微生物类群的生态关系9其他微生物研究技术n维诺格拉德斯基分离到硫细菌、铁细菌与硝化细菌；设计硅胶平板并改进直接观察土壤微生物的技术。n贝格林克证实蓝藻具有固氮能力，分离出根瘤菌纯培养，证实TMV通过植物汁液传播其他微生物研究技术n伊万诺夫斯基证知TMV的存在，发现超显微微生物世界n梅契尼科夫细胞免疫nP.Ehrlich体液免疫、并提出化学治疗概念10微生物药物研究历史n弗莱明nWansman链霉素nChain（半合成抗生素）6-APA7-ACA7-ADCAn梅泽滨夫提出酶抑制剂概念酶抑制剂nBestatin可抑制蛋白酶活性，可增强免疫反应n洛伐他丁与普伐他丁为HMG-CoA还原酶抑制剂，降低血液胆固醇浓度n免疫抑制剂环孢菌素A，FK506，雷帕霉素n受体拮抗剂aspercilin与L156当前寻找药物的热点：n建立新的筛选模型，寻找新活性物质n利用基因工程技术构建产生新次级代谢物的工程菌n扩大微生物来源n应用定向生物合成和突变生物合成的原理寻找新的代谢物n对已知化合物进行化学改造11厌氧菌研究技术n烛罐培养技术n钢丝绒技术、厌氧转管法和预还原技术n瓶皿法及厌氧手套箱厌氧菌的种类n根据对氧气的耐受性，分为三类：专性厌氧菌、微需氧菌与兼性厌氧菌。专性厌氧菌指不能利用分子氧作为电子终末受体，只能在低氧分压、低氧化还原电位下才能生长的细菌，分为三类：1、极端厌氧菌：空气中10分钟立即死亡2、中等厌氧菌：空气中6090分钟死亡3、耐氧厌氧菌：有氧条件下生长差、厌氧条件下生长好微需氧菌指在510CO2条件下才能生长很好的细菌，如弯曲菌、乳杆菌。12分子细菌学研究n从分子的、基因的、基因调控和表达的水平上研究细菌生命活动的基本现象和原理。分子细菌学与普通细菌学的区别分子细菌学基因型现象与导致原因化学本质的，基因产物修饰水平上普通细菌学表型现象细胞的，至多在某种因子水平分子细菌学与普通细菌学的区别n在细菌分类、鉴定方面n细菌毒力因子和致病机制n菌苗发展n细菌与环境n分子微生态学分子细菌学研究方法n以普通细菌学的观察为基础n把表现型基因型基因产物联系起来n基因缺失技术是研究基因功能的最佳方法n电子计算机技术n基因和菌株的改造13细菌基因组学n核苷酸和氨基酸的相似性和同源性不一定意味着功能的相似性几种菌的纯培养分离方法n弗兰克氏菌n海洋沉积物异养菌（Science296:1127-11292002)n海洋浮游细菌(Nature418:630-6332002)传统的微生物分离培养方法传统微生物培养缺陷n通用培养基对大多数极端环境下难培养微生物(99%以上)没有选择性。n培养条件很难与自然条件一致。n对微生物领域认识的局限。极端环境微生物培养方法归纳n模拟自然环境分离获得纯培养。n采用荧光标记已探测菌基因，追踪分离。n极端营养研究，实现微生物分离培养。Isolating“Uncultivable”MicroorganismsinPureCultureinaSimulatedNaturalEnvironmentT.KaeberleinK.LewisS.S.EpsteinBiologyDepartmentNortheasternUniversityBostonMA02115USAMarineScienceCenterNortheasternUniversityNahantMA01908USA.Science2002Vol.2961127-1129作者依据膜过滤原理和固定化技术，设计了一种新型的培养方式。在自然环境中，营养物质和代谢废物能通过膜，而细菌则在固定化培养过程中形成菌落。对于其生长机理的研究则有利于对环境中微生物的未可培养机理进行探讨。研究结果通过这种培养方法培养出来的微生物中（867）以上在培养皿上不能得到培养。其中得到能够在常规方法纯培养的都属于生长速度相对比较快速的微生物。通过这种新方法分离得到了新目级别的新物种。其中的一株菌MSC1不能在培养皿上独立生存，只有和其他的细菌（MSC2，MSC4或MSC5）一起才能维持生存。CultivationoftheubiquitousSAR11marinebacterioplanktoncladeMichaelS.RappeStephanieA.ConnonKevinL.Vergin&StephenJ.GiovannoniDepartmentofMicrobiologyOregonStateUniversityCorvallisOregon97331USANature2002Vol.418630-633研究过程n通过DNA检测，首先发现SAR11类细菌在海洋中大量存在。n设计该菌种的特异探针，并对其荧光标记，找到该菌位置。n对培养方法的探索，使该菌得到增殖达到分离并纯培养。研究结论nSAR11细菌是目前发现的最小的细菌（0.01m3）。n其与目前已知的蛋白细菌的最高相似度只有82，是一类全新的物种。n与普通细菌相比，SAR11类细菌偏好于无机营养成分，而不是复合有机养料。NewStrategiesforCultivationandDetectionofPreviouslyUnculturedMicrobesBradleyS.StevensonStephanieA.EichorstJohnT.WertzThomasM.SchmidtandJohnA.BreznakDepartmentofMicrobiologyandMolecularGeneticsMichiganStateUniversityEastLansingMichiganAppliedandEnviromentalMicrobiology2004Vol.7047484755设计了针对分离目标Acidobacteria和Verrucomicrobia的PCR引物，同时对照洗脱培养皿和培养孔板进行PCR反应，确定培养目标，然后进行培养筛选，最后在使目标达到了纯培养。极大地减少了培养过程中的盲目性，提高了实验效率。结论与思考n不同的微生物之间的培养方法有极大的差异，因此对极端难培养微生物的培养不能“一刀切”。n在研究培养方法时要充分借鉴其原始的生活环境和生理条件。n现有的分子生物学探测微生物多样性方面仍可能存在缺陷，未知基因的存在？未知微生物存在的可能性？n微生物本身生理情况？生长速度的局限？极端环境微生物培养之未来n极端环境微生物是一大类超越人们想象的丰富的未开发资源。n得到菌株，实现培养将为人类开发这资源提供更广阔的空间。n对其获得纯培养需要突破传统的分离观念，在方法学上下功夫。n某些特殊情况下纯培养是难以实现的，而共培养、共代谢是极端环境微生物培养的一个方向。活的但不能培养的微生物n快速生长的霍乱弧菌、大肠杆菌转到无营养的盐水中，经长时间低温保存，细胞数不减，代谢活力不变，但在正常条件下不形成菌落。14“不可培养微生物”研究技术n荧光探针标记n不同环境微生物DNA文库构建抽提DNA大片断DNA插入BAC载体转化大肠杆菌n利用组合生物合成将基因进行组合土样DNA获得PKS基因在链霉菌表达聚酮化合物