K062 有机相脂肪酶催化合成乳酸乙酯 赵天涛1 ,高静1 ，2 ,赵学明2,李伟杰1 ,张建华1 ,董明1 ,杨睿1 （1.河北工业大学化工学院,天津,300131； 2.天津大学化工学院,天津,300072） 摘摘 要要 考察了在双底物抑制下脂肪酶催化合成乳酸乙酯，叔丁醇是最佳溶剂，在所选的脂肪酶 中，固定化于大空丙烯酸树脂的南极假丝酵母脂肪酶B的催化活性最好。对反应进行优化，当酸 醇比为1：8、反应温度60、酸浓度0.3mol/L、酶浓度45g/mol、摇床转数200rpm时产率达77， 酶重复使用6次后产率仍然可达到60。 关键词关键词 催化 脂肪酶 酯化 乳酸乙酯 双底物抑制 ENZYMATIC ESTERIFICATION FOR ETHYL LACTATE SYNTHESIS IN ORGANIC MEDIA ZHAO Tiantao1, GAO Jing1,2,ZHAO Xueming2, LI Weijie1, ZHANG Jianhua1， DONG Ming1 and YANG rui1 Abstract Ethyl lactate was synthesized by lactic acid and ethanol, the best solvent is Tert-buty alcohol and the best lipase is Novozym 435. The optimization of the reaction was studied in detail, when the molar ratio(acid: alcohol) is 1:8 , the temperature is 60,the concentration of acid and lipase is 0.3mol/L and 45g/mol and the revolutions is 200 rpm, a conversion of 77% was reached. Novozym 435 can be used continuously for six times and a conversion of 60% can be reached. Keyword catalysis, lipase, esterification, ethyl lactate, Acid and alcohol inhibition 引言 乳酸乙酯是具有酒香的无色液体，它的特殊风味对酒的品质起着至关重要的作用1。而 且，乳酸乙酯具有无毒、溶解性好、不易挥发等优点，是极具开发价值和应用前景的“绿色 溶剂”2。目前国内外生产多采用传统的浓硫酸催化酯化法，该方法存在设备腐蚀严重、产 品质量差等缺点3。 酶催化具有活性高、专一性好、反应条件温和等优点 4。脂肪酶可以催化酯类化合物的 分解、合成和酯交换 5,6,7，因而被广泛应用于食品、精细化工和医药工业中。有机相脂肪酶 催化的研究极大地扩展了酶的应用范围。 国内外已有报道酶法合成其它乳酸酯和脂肪酸乙酯 8,9。乳酸的酸性较一般的有机酸强很多，乙醇又是酶的失活剂，而且乳酸无法与常见的有 机溶剂互溶， 这也就为寻找合适的体系增加了难度,所以乳酸乙酯的酶法合成至今未见报道。 本文对有机相脂肪酶催化合成乳酸乙酯进行了系统的研究，确定了最适的酶促酯化条件。 1 材料与方法 1.1 材料材料 Novozym 435（固定化于大空丙烯酸树脂的南极假丝酵母脂肪酶 B），CCL（非固定化 南极柱状酵母脂肪酶） ，Lipolase（茸毛腐质霉菌脂肪酶） ，Lipasezyme TL IM（固定化于硅 胶的嗜热真菌脂肪酶） ，PPL（非固定化猪胰脂肪酶） ，以上脂肪酶均购于诺维信公司。其它 试剂均购于天津试剂一厂，所有溶剂均为分析纯且在使用前均用分子筛脱水处理。 1.2 酶反应酶反应 除特殊说明以外， 所有反应均在恒温振荡水浴摇床中进行。 首先将一定比例的乳酸和乙 醇加入 5ml 的具塞锥形瓶中， 再加入一定体积的有机溶剂， 充分混和后加入一定质量的脂肪 酶，在特定的温度和摇床转速下反应一定的时间。采用气相色谱内标法测定产物乳酸乙酯， 产率的计算依照浓度较小的底物。水含量用 KF-2 型卡尔费休水分测定仪测定，试验使用未 经脱水的经济性乳酸，其含水量为 14.81%。 2 结果与讨论 2.1 溶剂的选择溶剂的选择 常用的溶剂由于无法和乳酸很好的互溶而失去了作用， 而可以和乳酸互溶的溶剂绝大部 分都和乙醇一样容易使酶失活，由表 1 可见，叔丁醇为溶剂产率最高。叔丁醇的突出的效果 可以从以下两点解释：第一，叔丁醇对酶的负面影响较之乙腈、丙酮小，而且叔丁醇的空间 位阻大， 由色谱分析， 未见其它峰的出现， 可以说明叔丁醇在脂肪酶的存在下未与乳酸反应； 第二， 叔丁醇较之氯仿等溶剂对乳酸的溶解有非常好的效果。 脂肪酶的催化机理一般均遵循 双乒乓机制10，而这一机制的前提就是单分子反应，乳酸既有羟基又有羧基，有图 1 可知 它在常态下以复杂的形式缔合11，叔丁醇对乳酸良好的溶解性可以保证其在较低温度下破 坏该缔合，而实现酶催化。所以，以下的试验均采用叔丁醇做溶剂。 表表 1 不同溶剂的产率比较不同溶剂的产率比较 溶剂 乳酸 酸醇混合溶 液 产率 丙酮 完全溶解 完全溶解 7.08% 乙腈 完全溶解 完全溶解 10.43% 氯仿 不溶 混溶体系 14.86% 苯 不溶 混溶体系 15.92% 甲苯 不溶 混溶体系 14.43% 环己烷 不溶 不溶 14.77% 叔丁醇 完全溶解 完全溶解 61.37% 酸醇摩尔比 1：4，底物总质量 0.8g，Novozym 435 50mg，溶剂 5ml，摇床转数 150rpm，反 应时间 24h，温度 50 H3C H C O C O- O H H- O C H CCH3 OHOH CHCOOHH3C HOH CHCOOHH3C O nCH3CHCOOH OH n Fig.1 乳酸缔合方程 2.2 脂肪酶的选择 选择了两种固定化脂肪酶和三种非固定化脂肪酶。 由于某些产物量过小， 检测以超出内 标曲线的线性范围，故均采用1%来表示。考虑到不同脂肪酶的最佳催化温度不同，催化反 应分别在 30和 60下进行。 由表 2 可知，N435 对于该反应是最好的催化剂。 表表 2 不同脂肪酶的催化效果不同脂肪酶的催化效果 酶的名称 60产率 30产率 Lipolase 2.89% 3.19% PPL 1% 1% CLL 1% 1% TL IM 1% 1% Novozym 435 63.20% 51.21% 酸醇摩尔比 1：4，底物总质量 0.4g，酶 50mg，叔丁醇 5ml，摇床转数 200rpm，时间 24h 2.3 温度的影响温度的影响 考察了不同温度下 Novozym 435 催化合成乳酸乙酯的活性变化。结果如图 2, 温度小于 60时，产率随着温度的升高而增加，60时达到最高产率 33.91，说明 Novozym 435 的 在较高的温度下可以发挥更大的催化活性。但温度高于 60时，由于酶的失活产率则呈下 降趋势，综上分析讨论，将体系的温度定为 60，并在此基础上进行其它条件的优化选择。 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 203040506070 反应温度() 产率 Fig.2 反应温度的影响 酸醇摩尔比 1：1，底物总质量 0.5g，Novozym 435 50mg，叔丁醇 10ml，摇床转数 200rpm，反应时间 24h 2.4 底物配比的影响底物配比的影响 固定乳酸的量， 与乙醇按一定摩尔比混合， 考虑到成本和乳酸含水量较高的问题主要考 察了乙醇过量的情况，结果如图 3。可以看出，开始时随着乙醇对乳酸摩尔比的增大，乳酸 乙酯的产率明显增大。 分析其原因主要是乳酸和乙醇的酯化反应是可逆反应， 增大乙醇的用 量，有利于反应平衡向乳酸乙酯的生成方向移动，从而提高了乳酸乙酯的产率。当酸醇比达 到 1:8 时，产率达到最大。但是随着乙醇的量继续增加，产率呈明显的下降趋势，可能的原 因是乙醇作为短链醇是酶的失活剂， 过量的乙醇随着浓度的提高必然对脂肪酶的失活的影响 会越来越强。由以上试验结果和分析得出结论：乳酸和乙醇的最优摩尔比为 1:8 能得到较高 的产率。 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 1:11:21:31:41:61:81:10 1:12 底物配比（酸/醇） 产率 Fig.3 底物配比的影响 Novozym 435 50mg，叔丁醇 5ml，摇床转数 200rpm，反应时间 24h，温度 60 2.5 乳酸浓度的影响乳酸浓度的影响 由图 4 可以得出结论： 乳酸产率先随着底物浓度的增加而缓慢增大， 当乳酸浓度增加到 0.3mol/L 时，产率达到最大值 73.90，乳酸浓度继续增加产率则呈现下降趋势。浓度高于 0.3mol/L 时，无论是乳酸的浓度还是乙醇的浓度都会增大，既降低了体系的 pH，又增大了 乙醇对酶的失活作用，使双底物的抑制作用更加明显，加速了 Novozym 435 的失活，因而 出现了产率的明显下降。综上分析，选定 0.3mol/L 为最优化的底物浓度。 50% 55% 60% 65% 70% 75% 80% 0.10.20.30.40.50.60.7 乳酸浓度（mol/L） 产率 Fig.4 底物浓度的影响 Novozym 435 50mg，叔丁醇 5ml，摇床转数 150rpm，反应时间 24h，温度 60 2.6 酶浓的影响酶浓的影响 酶浓度定义为酶的质量与纯乳酸的物质的量之比（单位是 g/mol） ，由图 5 可以看出， 产率随加酶浓的增大而增大。酶浓为 35g/mol 时产率达到 76.36，但酶浓度大于 35g/mol 后，产率的增长非常缓慢。酶浓为 45g/mol 时的产率可达到 77.15，但考虑产率和经济两 方面因素，选定最优酶浓为 35g/mol。 20% 40% 60% 80% 100% 5153545556575 酶的浓度（g/mol） 产率 Fig.5 酶浓的影响 酸醇摩尔比 1：8，底物总质量 0.7g，叔丁醇 5ml，摇床转数 200rpm，时间 24h，温度 60 2.7 摇床转数的影响摇床转数的影响 由图6可以看出，随着摇床转数的增加，产率呈上升趋势，转数在200rpm以下时，酸 醇摩尔比1：8，底物总质量0.7g，脂肪酶50mg，叔丁醇5ml，反应时间24h，温度60 传质对产率的影响较为明显。在转速大于200rpm以后，产率不再随转数的增大而增加， 这说明反应已经不再受外扩散的影响。 我们又在相同的反应条件下， 使用恒温水浴磁力搅拌 进行反应，试验结果一致，因此确定最优转速为200rpm。 40% 45% 50% 55% 60% 65% 70% 75% 80% 50100150200250 摇床转数（rpm） 产率 Fig.6 摇床转数的影响 2.8 脂肪酶的重复使用脂肪酶的重复使用 按照上述的优化条件，考察Novozym 435的重复使用。从图7可以看出，6批反应结束后 乳酸乙酯的产率仍可达60%以上，说明多次重复使用后，Novozym 435仍能保持较好的活性， 整个反应体系在此条件下有较好的操作稳定性。 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 123456 使用次数 产率 Fig.7 Novozym 435 重复利用稳定性的考察 3 结论 脂肪酶在有机相催化合成乳酸乙酯的成功说明了在双底物的强抑制下Novozym 435仍 然可以保持较高的活性。通过试验,证实了叔丁醇对底物的良好溶解和对酶较小的失活影响。 乳酸和乙醇的最佳摩尔比为1：8，酸浓0.3mol/L,酶浓45g/mol，温度60为最佳反应条件， 产率达到77。酶重复使