双孢蘑菇的培养与生物化学的研究进展 ( 综述) 芦 ? 笛* (屈原大学附属中学, 岳阳? 414000) 摘? 要? 主要介绍双孢蘑菇的营养成分与测定的方法、菌丝和子实体的生长条件与先进栽培技术、生物化学特 性, 以及菌株的鉴定等方面的研究成果与研究动态; 同时对双孢蘑菇子实体中某些具有医学价值的活性物质进 行了简介, 并作展望。 关键词? 双孢蘑菇; 培养条件; 伞菌氨酸; cDNA 文库 ? ? * 作者简介: 芦笛, 男, 汉族, 本科学历, 目前从事真菌学史和生物教学研究。 联系方式: 湖南省邱阳市金鹗东路, 414000; E- mail: ludiresearch 126 ?com。 ? ? 双孢蘑菇 ( Agaricus bisporus ( Lange) Sing?) ,简称蘑菇, 英文名通常为Button Mushroom 或 Common Culti? vatedMushroom,因担子上通常仅着生 2 个担孢子而得名。双孢蘑菇在分类上隶属真菌门, 担子菌纲,无隔 担子菌亚纲, 伞菌目, 蘑菇科, 蘑菇属, 是唯一确定了染色体组型 ( 含 13条染色体) 的食用菌栽培种。 1 双孢蘑菇的栽培源于16 世纪的法国, 距今已有300 年的历史, 在20 世纪 30年代初被引入我国,现已在全 国范围内得到了较大规模的栽培。 1? 双孢蘑菇子实体中的营养成分 1?1? 双孢蘑菇子实体营养成分的测定方法? 目前测定食用菌子实体中氨基酸含量的方法主要有两种: 氨 基酸分析仪测定法 2 和高效液相色谱 ( HPLC) 法 3 。与传统方法相比,这两种方法快速、精确、操作简 便。有报道指出, HPLC 法的准确性要高于氨基酸分析仪测定法。 4 而且, 氨基酸分析仪无法一次全部测出 18 种氨基酸的含量。其中色氨酸由于在酸中会分解,因此必须采用碱水解,进行再次测量。 5 采用 HPLC 法还可以测定双孢蘑菇的多糖、维生素和脂肪酸等物质。 1?2? 双孢蘑菇子实体中的营养成分 ? 双孢蘑菇子实体中含有丰富的营养成分。 6 8 根据吴素玲等的测定结 果,双孢蘑菇子实体干粉中粗蛋白含量为 37?86%,粗脂肪含量仅为 1?5% ;还原糖和多糖含量分别为 0?1% , 3?38% ; 含有K、Na、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、P 和 Se 等多种人体必需矿质元素;8 种必需氨 基酸含量占氨基酸总量的 42?30%;必需氨基酸与非必需氨基酸比值 ( E? N) 为 0?73;此外,还含有丰富 的多糖、纤维素、超氧化物歧化酶 ( SOD) 和核苷酸类物质。 9 Vetter 测定了 9 种双孢蘑菇菌株培养物中几 丁质占菌丝干重的含量,结果在 6?17% 8?88%之间。 10 如果将几丁质分子的乙酰基去掉, 则成为聚 D- 氨基葡萄糖, 亦即壳糖胺。壳糖胺具有增强人体免疫功能的作用。 11 2? 双孢蘑菇菌丝和子实体的生长条件 2?1? 双孢蘑菇不同菌株菌丝的最适生长条件 ? 双孢蘑菇有多种菌株。不同菌株菌丝最适生长条件不尽相 同。为了缩短菌丝萌发时间,得到生长速率快和浓密的菌丝,需要考虑多种因素的影响, 以及比较不同菌 株的菌丝生长情况。 12 14 影响菌丝生长的因素主要包括: 培养基种类、碳源种类、氮源种类、碳氮比、 pH、温度、光照和无机盐种类与浓度等。衡量菌丝生长状况的指标有:菌丝生长速率、菌丝密度、菌丝 萌发时间、菌丝满管时间、菌丝色泽、菌落形态等,并且以菌丝生长速率为最重要的指标。 赵占军等通过研究不同碳源、氮源、温度、培养基含水量、pH 和 CO2浓度对双孢蘑菇 2796 菌株菌丝 ?Zhejiang Shiyongjun 2009, 17( 2) : 23 28 生长的影响得出, 菌丝生长的最适碳源为麦芽糖,最适氮源为 ( NH4)2SO4,最适温度为 20 25 ? , 培养 基最适含水量为 60% 65%,最适 pH 为 6 7,光照抑制菌丝生长,适宜的 CO2浓度可刺激菌丝生长。 12 双孢蘑菇子实体不同部位组织分离出的菌丝生长状况不尽相同。组织分离法通常取菇柄和菌盖交界处的子 实体组织。 15 根据刘进杰等对双孢蘑菇子实体不同部位组织分离出的菌丝生长情况研究, 结果,在供试的 3 种培养基中,菌盖处的组织块萌发时间和菌丝满管时间均早于菌柄以及盖柄交界处的组织块。 16 海藻糖 (trehalose) 能够保护食用菌栽培种抵抗寒冷环境。Terashita 等研究发现, 在低温 ( - 16 ? ) 存储条件下, 与含相同质量葡萄糖的培养基相比, 海藻糖能够提高菌丝生长速率和存活率,且存活率随海藻糖含量的增 加而提高。 17 采用液体深层发酵技术,将母种菌丝块接种在液体培养基中进行震荡培养,可缩短培养时间。 18, 19 双 孢蘑菇菌丝生长在以谷氨酸或铵盐为 N 源的培养基上时,谷氨酸合酶 ( GS) 的合成活性大于转运活性。 谷氨酸合酶的活性与谷氨酸合成酶水平和 mRNA 水平密切相关。Kersten 等认为,双孢蘑菇中,可能只有 通过使此酶的合成受到抑制,才能使谷氨酸合酶 ( GS) 的作用受到调控。 20 有研究表明,在液体培养基中 添加NH4 + 并不抑制菌丝细胞对谷氨酸的吸收。这说明作为N 源,谷氨酸和 NH4 + 同等重要。但是, 组氨 酸和赖氨酸可以抑制双孢蘑菇菌丝对精氨酸的吸收, 这表明它们是一组竞争性抑制剂。在细胞内, NH4 + 浓度的增加使得细胞对甲胺和谷氨酸的吸收迅速降低,这可能与细胞内 NH4 + 浓度的反馈抑制系统有 关。 21 2?2? 提高双孢蘑菇子实体产量 ? 使用适合的培养基、对培养基作出改进 22 24 ( 改变组分的配比、添加或 减少某些营养成分) , 以及选择适宜的采收时期 25 是提高双孢蘑菇产量的几条途径。有研究表明,当潮菇 产量增加时, 蘑菇子实体平均质量呈下降趋势。 26 堆料温度、O2浓度、培养料消毒持续时间、培养料的含氮量, 也会影响双孢蘑菇产量。有研究表明, 堆料进行巴氏消毒的过程中, O2浓度为 7% 9%、温度在 58 61 ? 时,可使双孢蘑菇的产量达到最高。 而巴氏消毒超过6 h 后, 则对双孢蘑菇的产量没有影响。提高基质的含氮量 ( 从 1?6%提高到 3?1%) 可以 提高双孢蘑菇的产量。但若继续提高基质含氮量,则会使基质中氨含量上升,导致双孢蘑菇减产或不出 菇。 27 为了提高双孢蘑菇培养料中的氮含量,通常添加动物肥料。但是, 动物肥料在堆料过程中由于微生 物的作用会释放氨,而氨对工作人员的身体健康有害。为了减轻氨的释放, 通常会往培养料中添加氨抑制 剂。有研究指出, 氨抑制剂的使用在不影响双孢蘑菇的产量及其氨基酸含量的同时, 降低了氨的释放。 28 Han J 在菇潮之间将光合细菌 ( PSB) 悬浮液喷施于覆土上,结果显著增加了双孢蘑菇的产量;并且产量 与光合细菌悬浮液的浓度呈正相关。 29 这说明双孢蘑菇菌丝生长除了考虑培养温度、氧含量等非生命因子 外,与周围生物环境之间的作用也不可忽视。 提高双孢蘑菇产量,也需考虑节约成本。Gulser 和 Peksen 将生产茶叶过程中的废料与泥炭 1 1 混合作 为双孢蘑菇覆土材料, 发现此覆土材料和单一的泥炭相比,降低了生产成本, 而产量差异不显著。 30 实现 双孢蘑菇整个生产过程的自动化,可提高生产效率,有利于扩大生产规模。对于双孢蘑菇的采收, 国内主 要是由人工进行, 而国外已研发出可以自动采收的智能机器,这种机器在一个商业农场的试验中, 对双孢 蘑菇的采收率达 80% 以上。 31 3? 双孢蘑菇的生物化学研究 3?1? Se、Ce、Hg、胺、尿素以及H2O 在双孢蘑菇子实体中的存在情况 ? Se 是人体细胞中谷胱甘肽过氧化 物酶以及多种蛋白的重要组成成分, 在人体内有着重要的生理功能。Elteren 等人通过放射性示踪原子 75Se 和 134Ce 研究Se 和 Ce 元素在双孢蘑菇子实体中的积累以及二者在菌盖和菌柄中的分布, 结果表明, 这两种元 素在菌盖中的积累量要高于菌柄, 而由于 Ce 元素的惰性, Ce 在子实体中的含量要低于 Se; 最初加入培养基 质中的无机 Se 在蘑菇某些部位转变成了一些高分子量的 Se 化合物; 而一种低分子量的 Se 化合物仅出现在 !24!?2009 年 第 17 卷 第 2期 菌盖中, 这可能与孢子的形成有关。 32Vetter 和 Berta 测定了一个广泛栽培的双孢蘑菇菌株( K- 23) 中 Hg 的 含量, 发现同野生双孢蘑菇相比,此双孢蘑菇Hg 含量较低,且低于食用标准;而菌柄和菌盖以及不同菇 潮的蘑菇之间,Hg 含量差异不显著。 33 Kalac 和 Krizek 采用高效液相色谱 ( HPLC) 研究不同保存条件 ( 6 ? 、 20 ? ,整个子实体、湿润的蘑菇片、炖过的蘑菇片) 下双孢蘑菇子实体中胺的形成情况, 结果表 明, 温度对胺浓度水平无显著影响; 组胺和酪胺检测不到,且腐胺和尸胺的浓度不影响食用。 34 尿素在双 孢蘑菇子实体不同生长阶段中的积累情况有所不同。但无论处于哪个生长阶段, 菌盖的尿素含量均高于菌 柄;双孢蘑菇子实体中的尿素积累与鸟氨酸循环酶系,例如精氨酸酶的作用密切相关。 35 Donker 等采用核 磁共振成像技术 ( MRI) 研究双孢蘑菇收获期之后的细胞水分平衡, 发现环境造成蘑菇失水时,菌柄失水 量大于菌盖失水量;菌褶中的水密度比收获期前有所增加, 可能与孢子的形成有关; 恶化效应,诸如细胞 渗漏, 水份渗透压下降等, 仅出现在菌柄中。 36 3?2? 双孢蘑菇体内一些重要蛋白与基因的作用? 在体外条件下, 双孢蘑菇外源凝集素 ( ABL) 能够抑制 人视网膜色素上皮细胞 ( retinal pigment epithelium) 的收缩和黏附,且不出现明显的细胞毒性。ABL 的这种 特性使其作为一种治疗增生性玻璃体视网膜病变 ( proliferative vitreoretinopathy) 和非视觉的异常创伤愈合过 程的药物成为可能。 37 但是,也有报道指出,双孢蘑菇外源凝集素 ( ABL) 虽能提高小鼠 T 细胞线粒体基 因活性, 却并不表现出促进细胞增生作用;并且, ABL 还能引发细胞凋亡。 38 另有研究表明, ABL 可以作 为一种鉴定和分离人 IgA 免疫球蛋白的有效工具。 39 伞菌氨酸 ( agaritine) 是双孢蘑菇子实体中的一种致癌物质。伞菌氨酸能够阻止黑色素的生成, 40 且其 酸水解物可使 DNA 断裂。Hiramoto 等研究发现, 双孢蘑菇子实体中的 ?- 谷氨酸转移酶能够催化伞菌氨酸 水解为4- 羟甲基偶氮苯 (HMBD) , 而HMBD 为一种致癌物质。其在 pH 7?4, 37 ? 条件下能产生一种活 跃分子 羟甲基苯#, 它能够使 DNA 发生链断裂。将超螺旋质粒 DNA 置于HMBD 的磷酸缓冲液中, 在 pH 7?4、37 ? 条件下作用 30 min,结果, 质粒超螺旋 DNA 逐渐转变为松弛环状, 随后变成线状。这表明此化 合物对DNA 链有裂解作用。通过DNA 片断序列分析显示, 裂解作用无特异性。在氧气和超氧化物的存在 下, HMBD对 DNA 的裂解作用活跃, 但在氢供体存在条件下,裂解作用受到阻断。 41 Pilegaard 等给A? J 肺 肿瘤模型小鼠饲喂半合成饲料, 考察饲料中双孢蘑菇干粉中高剂量 ( 166 mg/ kg 体重) 伞菌氨酸的致癌作 用,统计分析显示,小鼠患肺腺瘤率并未显著增加。 42 这表明,提纯的伞菌氨酸虽然有致癌作用,但在食 用的双孢蘑菇子实体中,可能同