分类号 华中农业大学硕士学位论文 IS304 6 密级 棉花纤维发育伸长期和次生壁加厚期数字表达谱分析 A n a l y s i so ft h ed i g i t a lg e n ee x p r e s s i o np r o f i l i n go fc o t t o nf i b e r d e v e l o p m e n td u r i n gc e l le l o n g a t i o na n ds e c o n d a r y c e l lw a l lb i o g e n e s i s 研究生：闰恒超 指导教师：袁有禄教授 答辩小组：林拥军教授 柳俊教授 刘子铎教授 熊立仲教授 邢永忠教授 专业：生物化学与分子生物学研究方向：棉纤维发育分子生物学 获得学位名称：理学硕士获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学生命科学技术学院 二0 0 年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 1 7 9 9 7 2 7 f 嬲1 学位论文 召 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： l 司日匿盎 时间：沙l 。年 占月加日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书。 学位敝储张阂1 3 班导师签名剜梧 签名日期：渊年6 月x 日 签名日期：压勿年易月勿日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 棉花纤维发育伸长期和次生壁加厚期数字表达谱分析 目录 摘要I A b s t r a c t I I I 英文缩略表V l 前言l 1 1 棉花概述l 1 2 棉纤维的发育过程2 1 3 棉纤维发育的分子生物学研究进展3 1 3 1 棉纤维分化起始的调控3 1 3 2 棉纤维伸长期基因的表达调控4 1 3 3 棉纤维次生壁加厚期基因的表达调控6 1 3 4 棉纤维脱水成熟期的研究7 1 4 基因工程改良棉纤维品质研究进展7 1 4 1 增加纤维长度和强度的纤维改良工程8 1 4 2 增强纤维保暖性9 1 4 3 彩色棉的基因工程。1 0 1 5 差异表达基因的研究进展l O 1 5 1 差异表达基因概述。1O 1 5 2 筛选差异表达基因的方法。l O 1 5 3S o l e x a 表达谱特点l l 1 6 本研究的目的及意义1 l 2 材料与方法1 3 2 1 试验材料1 3 2 1 1 试验群体的构建。1 3 2 1 2 材料种植及棉纤维的取材1 4 2 2 棉纤维总R N A 的提取。1 4 2 2 1 实验器具的处理1 4 2 2 2R N A 提取液的配制1 4 2 2 3R N A 提取步骤15 2 3 反转录和荧光定量P C R 试验1 6 2 3 1e D N A 第一条链的合成16 2 3 2 荧光定量P C R 1 6 2 4T a g 的制备及测序l7 2 5 测序数据分析1 8 2 5 1 数据的处理及标准化1 8 2 5 2T a g 的基因注释和差异基因的筛选1 9 2 5 2 1T a g 的基因注释1 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 5 2 2 差异表达基因的筛选1 9 2 5 3G e n eO n t o l o g y 功能显著性富集分析1 9 2 5 4 差异基因表达模式聚类分析和P a t h w a y 显著性富集分析2 0 3 结果与分析2 l 3 1 对蛆提取质量检测2 1 3 2 测序质量评估2 2 3 2 1T a g 整体质量评估2 2 3 2 2C l e a n T a g 拷贝数分布统计。2 2 3 2 3T a g 的基因注释2 6 3 2 4 差异表达基因的筛选。2 8 3 2 5 表达模式聚类分析31 3 2 6G e n eO n t o l o g y 功能显著性富集分析3l 3 2 7P a t h w a y 显著性富集分析3 4 3 2 8 荧光定量P C R 验证纤维发育伸长期和次生壁加厚期差异表达的基因4 2 4 讨论4 7 4 1 棉花不同组织R N A 提取的探讨一4 7 4 2 用E S T 和U n i g e n e 做比对库的比较4 8 4 3 棉纤维伸长期和次生壁加厚期基因表达的情况4 9 4 4 纤维发育伸长期和次生壁加厚期基因表达的差异4 9 4 5 高纤维强度和低纤维强度材料纤维发育次生壁加厚期差异基因及代谢过程5 0 4 6 棉纤维超微结构及棉铃发育时间长短对棉纤维强度的影响5 l 4 7 荧光定量与S o l e x a 测序结果的比较5 2 4 8 本研究的不足以及进一步研究的思路5 2 5 全文结论5 3 参考文献5 4 j g 【谢6 l 棉花纤维发育伸长期和次生壁加厚期数字表达谱分析 要 棉花是重要经济作物，它不仅提供了世界上绝大部分天然纤维，而且是重要的 食用油及蛋白质来源。棉纤维不仅具有重要的经济价值，也是理想的研究细胞伸长 和纤维素合成途径的模式细胞。近年来通过大量的表达序列标签( E S T ) 测序和基 因芯片表达分析，已经成功分离大量与纤维发育相关基因，并已进行初步的功能验 证。但是这些研究主要集中在纤维的起始和伸长发育阶段，而对于纤维的次生壁加 厚期，以及纤维伸长期和次生壁加厚期代谢过程的差异研究较少。 从经多年自交创制的1 9 6 个重组自交系( s G K 9 7 0 8 x 0 1 5 3F ) 中挑选2 个纤维 强度差异较大的系( 6 9 3 0 7 和6 9 3 6 2 ) ，利用不同时期的发育棉铃( 1 0 D P A 、1 5 D P A 、 2 0 D P A 、2 3 D P A 、2 5 D P A ) 提取棉纤维R N A ，建立了9 个不同纤维发育时期标签文 库，采用最新的测序技术S o l e x a ，对建立的标签文库进行表达谱测序。每个文库进 行单独测序，平均每个文库得到约31 2 万个序列标签，进一步对序列标签用U n i g e n e 进行基因注释。通过对序列标签进行相互比较发现，在棉纤维发育伸长期和次生壁 加厚期中表达的基因不仅在数目上有差异，而且在种类上也有差异，每个纤维发育 阶段有大量特异表达基因。通过统计分析，筛选出一些在纤维伸长期具有较高表达 量的基因，包括脂类转运蛋白、金属硫蛋白、水通道蛋白P I P 2 和长链脂肪酸延伸 酶，暗示这些基因可能与纤维伸长发育有关。筛选出纤维次生壁发育期具有较高表 达量的基因，包括阿拉伯半乳聚糖、纤维素合成酶、微管蛋白、l ，4 1 3 葡聚糖酶和 果糖醛缩酶等，暗示着这些基因可能与纤维次生壁发育有关。同时我们挑取7 个在 纤维伸长期和次生壁加厚期存在明显表达差异的基因，采用荧光定量P C R 的方法对 这7 个差异表达的基因进行分析，来检验测序数据的准确性。 通过对测序数据的分析，主要得到以下结论：( 1 ) 在纤维发育过程中，占基因 种